等度洗脱和梯度洗脱条件的确定

对于常规样品而言，在初始设置方法时可以先参考以下初始条件设置：

20分钟内，将有机相比例从5-10%线性升高至100%，并保持一段时间以保证所有组分被洗脱出来。

如果在梯度结束后，有组分的洗脱时间超过梯度时间的25%，也就是该条件中如果有化合物在25分钟之后被洗脱出来，则需要考虑更换保留能力更弱的色谱柱或更换极性更强的有机溶剂。

我们可以通过以下公式来计算：

我们可以看出 ΔtG>0.25 tG，所以该方法不适合等度洗脱。

适合等度洗脱的方法要求 ΔtG<0.25tG。

1、等度洗脱如何设置

如果你的方法适合等度洗脱，那么又该如何设置呢？

我们还以上面的这个样品为例，可以参考如下计算：

tr(avg)=(ti+tf)/2=17min

Δ%B/min=(%Bfinal-%Binitial)/tG=(100-5)/20=4.75 %B/min

等度洗脱流动相比例=(Δ%B/min x tr(avg))+%Binitial=(4.75x17)+ 5=85.75≈86%B

综上所述，如果该样品可以用等度洗脱，那么方法设置为：水相与有机相比例为14：86，保持17min。

方法设置时可以参考以上条件设置，如果做出来的图形不能完全满意，在此基础上微调即可。

2、梯度洗脱如何设置

如果该样品需要做梯度洗脱，方法参数又该如何设置呢？

梯度洗脱主要包括以下几个参数：初始流动相比例、结束流动相比例和流动相变化速率，同样以之前的样品为例：

Δ%B/min=(%Bfinal-%Binitial)/tG=(100-5)/20=4.75 %B/min

调整后的初始流动相比例

Optimized%Binitial

=(%Binitial+(tixΔ%B/min))-(V/FxΔ%B/min)-10%B

=(5+(12.786x4.75))-(5.5/2x4.75)-10

=42.67%B

调整后的结束流动相比例

Optimized%Bfinal

=(%Binitial+(tfxΔ%B/min))-(V/FxΔ%B/min)-10%B

=(5+(21.142x4.75))-(5.5/2x4.75)-10

=82.36%B

通过计算得到调整后的初始流动相比例等于42.67%，调整后的结束流动相比例等于82.36%。

如果按照以上计算出来的条件，流动相从42%到83%，运行时间20min，得到的样品图如下所示：

在方法开发时，同学们可以在以上基础谱图下再次进行调整，直到达到满意的分离度和分析时间。