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猪肝组织中氯霉素残留检测方法——高效液相色谱一串联质谱法(一)
【来源/作者】周世华 【更新日期】2017-01-03

1、安全要求

实验操作时穿工作服、戴口罩和手套;提取和净化操作都应在通风橱中进行,避免溶剂气体吸入和皮肤接触;废弃的化学试剂收集到专用容器中集中处理。

2、急救措施

皮肤接触到有机溶剂或酸、碱溶液后用清水清洗,有机溶剂或酸、碱溶液溅入眼中用清水灌洗。

3、适用范围

该标准操作规程适用于猪肝组织中氯霉素残留量的确证检测。

4、职责

进行该项检验的检验员必须按该标准操作规程进行检验,质量监督员负责监督该标准操作规程的正确执行。

5、检测原理

采用间位氯霉素或氯霉素-D5作内标,试料依次用乙腈、4%氯化钠去蛋白,正己烷脱脂,乙酸乙酯提取,固相萃取柱净化,氮气吹干。用高效液相色谱一串联质谱法测定,内标法定量。

6、方法灵敏度

氯霉素在猪肝组织中的检测限为0.1μg/kg,定量限为0.2μg/kg。

7、注意事项

除特别说明外,预洗、淋洗和洗脱过程中应避免萃取柱柱床干涸。

8、材料、仪器、试剂的准备及基本要求

除特别注明外,以下所用试剂均为分析纯;水为符合GB/T 6682规定的一级水。

8.1 对照品、试剂和药物储备液、工作液准备

8.1.1 氯霉素标准品(CAP)

8.1.2 内标间位氯霉素(m-CAP)或氯霉素-D5标准品

8.1.3 乙腈 色谱纯

8.1.4 氯化钠

8.1.5 正己烷

8.1.6 乙酸乙酯

8.1.7 甲醇 色谱纯

8.1.8 C18固相萃取柱 (500mg/3mL)

8.1.9 4%氯化钠溶液 称取氯化钠4.0g,用水溶解并稀释至100mL,临用前配制。

8.1.10 水饱和乙酸乙酯溶液 取乙酸乙酯400mL于500mL棕色试剂瓶中,加水50mL,加盖、振摇,静置,使用时取上层溶液。

8.1.11 氯霉素标准储备液(100μg/ml)取氯霉素约l0mg,精密称定,置100mL量瓶中,用甲醇超声溶解并稀释成浓度为100μg/ml的标准储备液。置-20℃冰箱中保存,有效期为6个月。

8.1.12 间位氯霉素(或氯霉素-D5)内标储备液(100μg/mL) 取间位氯霉素l0mg (或氯霉素-D510.15mg),精密称定,置100mL量瓶中,用甲醇超声溶解并稀释成浓度为100μg/mL的内标储备液。置-20℃冰箱中保存,有效期为6个月。

8.1.13 氯霉素标准工作液(10ng/mL) 准确量取标准储备液0.1mL,置一10mL量瓶中。用流动相稀释成浓度为1μg/mL的标准工作液;从中准确量取0.1mL,置一10mL量瓶中,用流动相稀释成浓度为10ng/mL的标准工作液。置40C冰箱中保存,有效期为3个月。

8.1.14 内标工作液(10ng/mL) 准确量取内标储备液0.1mL,置一l0mL量瓶中,用流动相稀释成浓度为1μg/mL的内标工作液;从中准确量取0.1mL,置一l0mL量瓶中,用流动相稀释成浓度为l0ng/mL的内标工作液。置4℃冰箱中保存,有效期为3个月。

8.2 仪器和设备

8.2.1 高效液相色谱-串联质谱仪(配电喷雾离子源)

8.2.2 天平 感量0.01g

8.2.3 分析天平 感量0.00001g

8.2.4 涡旋振荡器

8.2.5 组织匀浆器

8.2.6 低温离心机

8.2.7 样品浓缩仪

8.2.8 固相萃取装置

8.2.9 微孔滤头 0.45μm

9 检验步骤

9.1 试料的制备

9.1.1 取匀浆后的供试样品,作为供试试料。

9.1.2 取匀浆后的空白样品(5±0.05)g,作为空白试料(阴性对照)。

9.1.3 取匀浆后的空白样品(5±0.05)g,添加l0ng/mL的标准工作液150μL和l0ng/mL的内标工作液250μL,作为空白添加试料(阳性对照)。

9.2 提取

9.2.1 取供试试料(5±0.05)g置50mL离心管中,加10ng/mL的内标工作液250μL,加乙腈5mL,4%氯化钠溶液5mL,涡旋混匀,5000r/min离心10min,取上清液至另一50mL离心管中。

9.2.2 残余物中再用乙腈5mL重复提取1次,合并提取液。

9.2.3 提取液中加正己烷5mL,涡旋振荡1min,2 000r/min离心10min,弃去上层液,再重复提取1次。

9.2.4 加水饱和乙酸乙酯溶液5mL,涡旋振荡1min,2 000r/min离心10min,将上层液转移到15mL离心管中。

9.2.5 重复提取1次,合并提取液氮气吹干,用水-乙腈(95+5,v/v)3mL溶解,备用。

9.3 净化

9.3.1 固相萃取柱依次用甲醇10mL,水10mL预洗。

9.3.2 取上述备用液过柱。

9.3.3 用水3mL淋洗柱子。

9.3.4 用流动相4mL以1mL/min的速度将样品洗脱人15mL离心管中。

9.3.5 洗脱液中加水饱和乙酸乙酯溶液4mL,涡旋振荡1min,2 000r/min,离心5min。取上层液于10mL玻璃试管中。

9.3.6 再用水饱和乙酸乙酯溶液4mL,重复提取1次,合并提取液,氮气流下吹干,用流动相1.0mL溶解后,供高效液相色谱-串联质谱测定。

9.4 测定条件

9.4.1 色谱条件

9.4.1.1 色谱柱:Alhech Altima C18 150mm×3.2mm(i.d.),粒径5μm。

9.4.1.2 流动相:甲醇-水(50+50,v/v)。

9.4.1.3 流速:0.4mI/min。

9.4.1.4 柱温:30℃。

9.4.1.5 进样量:20μL。

9.4.2 质谱条件

9.4.2.1 离子源参考参数,见表1。

9.4.2.2 质量分析器参考参数见表2。

9.4.2.3 光电倍增器电压:650V。

9.4.2.4 定性、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量见表3。

参考资料:兽药残留检测标准操作规程


【关键词】氯霉素,液相色谱,串联质谱法,奥科官网,北京世纪奥科 

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