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猪尿中盐酸克仑特罗残留检测方法——气相色谱一质谱法
【来源/作者】周世华 【更新日期】2017-01-07

1、安全要求

实验操作时穿工作服、戴口罩和手套;提取和净化操作都应在通风橱中进行,避免溶剂气体吸入和皮肤接触;废弃的化学试剂收集到专用容器中集中处理。

2、急救措施

皮肤接触到有机溶剂或酸、碱溶液后用清水清洗,有机溶剂或酸、碱溶液溅人眼中用清水灌洗。

3、适用范围

该标准操作规程适用于猪肝中盐酸克仑特罗残留量的检测。

4、职责

进行该项检验的检验员必须按该标准操作规程进行检验,质量监督员负责监督该标准操作规程的正确执行。

5、检测原理

试料残留的盐酸克仑特罗经提取、净化、洗脱、双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生后,用气相色谱一质谱仪测定,外标法定量。

6、方法灵敏度

盐酸克仑特罗在猪肝中的定量限为0.5μg/kg。

7、注意事项

7.1 过柱净化时上样、淋洗、洗脱的流速保持在1~2mL/min

7.2 衍生化过程中,注意保持干燥。

8、材料、仪器、试剂的准备及基本要求

除特别注明外,以下所用试剂均为分析纯;水为符合GB/T6682规定的一级水。

8.1 对照品、试剂、材料和标准储备液、标准工作液准备

8.1.1 盐酸克仑特罗含盐酸克仑特罗不得少于98.5%。

8.1.2 盐酸

8.1.3 乙酸乙酯

8.1.4 无水甲醇

8.1 5 氨水

8.1.6 异丙醇

8.1.7 乙酸

8.1.8 乙酸铵

8.1.9 0.03mol/L盐酸溶液取盐酸2.7mL,加水稀释至1000mL。

8.1.10 4%氨化甲醇溶液取氨水4.0mL,加甲醇稀释至100mL。

8.1.11 SCX固相萃取柱Supelclean 500mg,3mL。

8.1.12 C18固相萃取柱Supelclean 500mg,3mL。

8.1.13 0.02mol/L乙酸铵缓冲液(pH5.2) 取乙酸铵1.45g溶于800mL水中,用乙酸调pH值为5.2,并用水稀释至1000mL。

8.1.14 乙酸乙酯一异丙醇混合液(60:40) 取乙酸乙酯600mL,加入异丙醇400mL,混匀即得。

8.1.15 双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA) 德国,Aldrich公司

8.1.16 标准储备液的制备(1mg/mL) 准确称取盐酸克仑特罗标准品约25mg至25mL量瓶中,用无水甲醇溶解并稀释至刻度,即得。置-200C冰箱中保存,有效期1年。

8.1.17 标准工作液A的制备(10μg/mL) 取储备液0.5mL至50mL量瓶中,用无水甲醇稀释至刻度,即得。置4℃冰箱中保存,有效期3个月。

8.1.18 标准工作液B的制备(100μg/L) 取工作液A 0.5mL至50mL量瓶中,用无水甲醇稀释至刻度,即得。置4℃冰箱中保存,有效期1个月。

8.1.19 对照溶液的制备 分别取工作液B 5μL、25μL、50μL、100μL、500μL、1 000μL,按照9.3.6到9.4.2操作,得到1μg/L、5μg/L、l0μg/L、20μg/L、l00μg/L、200μg/L 6个浓度点的对照溶液,临用前制备。

8.2 仪器和设备

8.2.1 GC-MS Agilent 6890-5973型,EI源

8.2.2 分析天平精度0.000 01g,METTLER AE240型

8.2.3 分析天平精度0.01g

8.2.4 具塞离心管50mL

8.2.5 具螺旋盖玻璃试管5.0mL

8.2.6 匀浆机NISSEI AM-6型

8.2.7 离心机Himac CF16RX型

8.2.8 涡旋混合器IKA MS2型

8.2.9 酸度计METTLER Toledo 320型

8.2.10 真空泵Millipore WP6122050型

8.2.11 固相萃取装置ALLTECH 24孔

8.2.12 干燥箱ESPEC LC-213型温度范围40~250%,精度±10C

8.2.13 样品浓缩器PIERCE IL61105型

9、检验步骤

9.1 试料的制备

9.1.1 取混匀后的供试样品,作为供试试料。

9.1.2 取混匀后的空白样品,作为空白试料(阴性对照)。

9.1.3 取空白试料(5±0.05)g,添加100μg/L盐酸克仑特罗标准工作液B 100μL,作为空白添加试料(阳性对照)。

9.2 提取

9.2.1 精密量取供试试料5mL于聚丙烯离心管中,用乙酸将pH值调至5.2。

9.2.2 加入0.02mol/L乙酸铵缓冲液1.0ml,混匀。

9.2.3 加入乙酸乙酯一异丙醇混合液(60:40)10.0ml,涡旋混合2min,静置至上层液澄清,收集上层液。用乙酸乙酯一异丙醇混合液(60;40)重复提取一次,合并两次提取液于具塞玻璃试管中。

9.2.4 提取液于50~60℃水浴下用氮气吹干。

9.2.5 取0.02mol/L乙酸铵缓冲液2.0mI.溶解残余物,作为备用液。

9.3 净化

9.3.1 用Sep Pek真空接头将C18和SCX固相萃取柱按从上到下的顺序连接,并置于固相萃取装置上。

9.3.2 依次用无水甲醇5.0mL、水5.0mL和0.03mol/L盐酸溶液5.0mL活化萃取柱。

9.3.3 将备用液过柱,并用0.02mol/L乙酸铵缓冲液1mL清洗玻璃试管,清洗液过柱。

9.3.4 依次用水5.0mL、无水甲醇5.0mL淋洗萃取柱;真空抽干,弃去C18柱。

9.3.5 用4%氨化甲醇溶液5.0mI洗脱,流速不得超过0.5mL/min,收集洗脱液于另一具塞玻璃试管中。

9.3.6 洗脱液于50~60℃水浴下用氮气吹干。

9.4 衍生化

9.4.1 取甲苯100μL溶解残余物。

9.4.2 加入:BSTlFA 100μL,加盖,于涡旋混合器上混匀。

9.4.3 于80℃干燥箱中加热1h,冷却后,加入甲苯0.3mL,混匀后移人进样瓶中。

9.5 测定

9.5.1 气相色谱条件

9.5.1.1 色谱柱:HP-5MS 5%苯基甲基聚硅氧烷,30m×0.25mm(内径),0.25μm(膜厚)。

9.5.1.2 进样口:220%:。

9.5.1.3 进样方式:不分流。

9.5.1.4 进样体积:1μL。

9.5.1.5 柱温:70℃(保持0.6min),以250C/min升温至220℃(保持6min),以250C/min升温至280℃(保持5min)。

9.5.1.6 载气:氦气,流速0.9mI/min(恒流)。

9.5.2 质谱条件

9.5.2.1 EI源。

9.5.2.2 GC/MS传输线温度:280℃。

9.5.2.3 溶剂延迟:8min。

9.5.2.4 EM电压:高于调谐电压200V。

9.5.2.5 分析器温度:230℃。

9.5.2.6 四极杆温度:150℃。

9.5.2.7 选择离子监测:(M/Z)86、243、262、277。

9.5.2.8 定量离子:86。

9.6 测定法

9.6. 1 将系列对照溶液依次从低浓度到高浓度测定,按其所得峰面积与相应的对照溶液浓度作标准曲线,并计算回归方程及相关系数。

9.6.2 取试样溶液和相应的对照溶液(20μg/L),作单点校准,按外标法以峰面积计算,即得。对照溶液及试料溶液中盐酸克仑特罗响应值均应在仪器检测的线性范围之内。

9.6.3 空白试验

除不加试料外,采用完全相同的测定步骤进行平行操作。

9.7 记录与计算

9.7.1 记录

9.7.1.1 逐项填写中国兽医药品监察所“检验记录”首页。

9.7.1.2 对照品名称、来源、批号、含量。

9.7.1.3 储备液、工作液及对照溶液制备及制备日期。

9.7.1.4 试料制备、提取、净化、测定(包括测定过程中涉及的计量仪器编号)。

9.7.1.5 原始数据(包括仪器测定图谱和打印的数据)。

9.7.1.6 计算公式及计算过程(软件计算除外)。

9.7.2 计算

按下式计算供试试料中盐酸克仑特罗的残留量:

式中:

X——试料中盐酸克仑特罗的含量(μg/kg);

CS——标准溶液中盐酸克仑特罗含量(μg/L);

Ai——试液中经衍生化盐酸克仑特罗峰面积;

AS——标准溶液中经衍生化盐酸克仑特罗峰面积;

V1——样液最终定容体积(mL);

V2——供试试料的量(mL)。

(注:计算结果需扣除空白值,测定结果用平行测定的算术平均值表示,保留3位有效数字)

9.8 结果判定

9.8.1 线性范围 在1~200μg/L范围内考察线性,计算回归方程,其相关系数≥0.99。

9.8.2 准确度 本方法在0.5~2μg/kg添加浓度范围内的回收率为60%~120%。

9.8.3 精密度 本方法的批内变异系数≤30%,批间变异系数≤30%。

9.8.4 匹配度 试料峰与标样峰的保留时间之差不超过2s,特定结构离子的相对丰度与标准品的匹配度应当在±15%之内。

若方法学考察符合以上规定,则供试试料中药物的残留量X<定量限时,判定为符合

规定;X≥定量限时,判定为不符合规定。或按照检测任务要求的定量限(>0.5μg/L时)判定。

10 附加说明

10.1 本标准操作规程依据农业部1025号公告制定。

10.2 盐酸克伦特罗最高残留量:

参考资料:兽药残留检测标准操作规程


【关键词】盐酸克仑特罗,气相色谱,质谱法,奥科官网,北京世纪奥科 

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