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氨基酸的测定(三)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-02-25

4、试剂

(1)磷酸盐缓冲溶液:称取磷酸二氢钾(KH2PO4,分析纯)3.40g,草酸(H2C2O4·2H2O,分析纯)) 20.0g,分别溶于水中,定量地转入1000mL容量瓶中。然后再加入磷酸(H3PO4 ,p=1.69g·cm-3,分析纯)1.7mL,冰乙酸(CH3COOH,分析纯)60mL和丙酸(CH3CH2COOH,分析纯))1mL,用水定容。

(2)染料溶液:称取酸性橙12#(C16H11O4N2SNa)1.363g,用磷酸盐缓冲液溶解并稀释至1000mL。此溶液的浓度为c(C16H11O4N2SNa)=3.89mmol·L-1,染料的来源和纯度不同,须对染料的浓度进行校正。

(3)半饱和乙酸钠溶液:取一定量的无水NaOAc或NaOAc·3H2O(分析纯),先配成饱和溶液,再用等体积水稀释为半饱和溶液。

(4)丙酸酐(C6H1003,化学纯)。

5、操作步骤

(1)标准曲线的绘制分别吸取染料溶液(试刘2)28.3mL、30.9mL、33.4mL、36.0mL、38.6mL、41.1mL、43.7mL、46.3mL、48. 9 mL置于100 mL容量瓶中,用磷酸盐缓冲液(试剂1)或水定容,即得浓度为1.1 mmol·L-1、1.2 mmol·L-1、1.3 mmol·L-1、1.4 mmol·L-1、1.5 mmol·L-1、1.6 mmol·L-1、1.7 mmol·L-1、1.8 mmol·L-1、1.9 mmol·L-1、的染料工作溶液。吸取各工作液20.00mL分别加入半饱和乙酸钠溶液(试剂3)2.00 mL及磷酸盐缓冲液(试剂1)0.20mL,充分混匀,在GXD-201型蛋白质分析仪上测定透光率T值。在半对数坐标纸上,以透光率为纵坐标,染料浓度为横坐标,绘制工作曲线。(也可以用磷酸盐溶液稀释50倍后,用0.5cm比色槽和482 nm波长,以721型分光光度计测吸收值A,用普通直线坐标纸绘制工作曲线)。

(2)样品的测定:按表38-2的规定称取已粉碎过60目筛酰化和不酰化样品各两份,准确至0.4mg。分别加入30 mL~35mL具塞玻璃的或聚四氟乙烯的试管中,标明为A,B管(酰化样品)和C,D管(不酰化样品)。同时应另称样品测定水分含量。

丙酰化反应:应各管分别加入160g·L-1乙酸钠溶液2.OOmL (灿稻加80g·L-1乙酸钠溶液),然后加丙酸酐(试剂4)0.20mL于A,B管中,加磷酸盐缓冲溶液(试剂1)0.20 mL于C,D管中。盖紧塞子,放置在往复振荡机上振荡10 min。

染料结合反应:向A,B,C,D管中各加入染料溶液〔试荆2)20.00 mL,盖紧塞子,置于振荡机上振荡lh(灿稻、豆类试样需2h,油料种子需2h或更长),使染料结合反应达到平衡。

离心:将以上反应液在3000r·min-1~4000 r·min-1下离心10min。

测定:在GXD-201型蛋白质分析仪上测透光率T值或721型分光光度计上测吸收值A值。

6、结果计算

由测得透光率T或吸收值A,在标准曲线上查得可由回归线计算得到的剩余染料溶液的浓度(mmol·L-1),则样品中的赖氨酸的浓度按下公式计算:

式中:CA. B、Cc.D——各为酰化与不酰化样品的剩余染料溶液浓度,mmol·L-1

mA.B、mc.D——各为酰化与不酰化样品质量,g;

20——为加入染料溶液量,mL;

1.11——为(20+2+0.2)与20之体积比;

3.89——酸性橙红染料溶液初始浓度,mmol·L-1;

146.2——赖氨酸的摩尔质量,g·mo1-1

参考资料:土壤农业化学分析方法

相关链接:

氨基酸的测定(一)



【关键词】基酸,农业植物,游离氯基酸,国家标准物质网 

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