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蛋白质和氨基酸的测定(一)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-03-04

一、分析意义

蛋白质是生命的物质基础,它的含量是衡量农、畜、水产品品质的重要指标,在育种、食品和饲料等工作中常常需要测定蛋白质的含量。

氨基酸是组成蛋白质的基本单位,也是蛋白质的分解产物。全氨基酸和个别氨基酸的分析测定是研究蛋白质、酶的化学组成及性质的重要手段。生物学及农业科学的许多领域都需要分析氨基酸。在评价谷物的蛋白质营养价值时需要测定游离氨基酸及蛋白质的氨基酸组成。动植物产品中的氨基酸以多种形式存在,大致可分为两种,即构成蛋白质的氨基酸和游离的氨基酸,另外,还有少量的由肽键连接的几个氨基酸,以及与糖或脂结合在一起的。在人类和动物营养学上,各种氨基酸含量的高低是很重要的,特别是有几个限制性氨基酸,如称为“第一、第二限制氨基酸”的赖氨酸和色氨酸,是一种必需氨基酸,即必须从食物中直接吸收,而不能由人与动物利用食物中的其它成分自身合成,却又对人与动物的生长发育起着重要作用的氨基酸;若缺乏这些氨基酸,人与动物不仅不能正常发育,还会引起某些疾病,而这些氨基酸在贮存和加工的过程中极易损失破坏,因此它们的实际含量已成为衡量谷物、饲料蛋白质的重要标准之一。

二、蛋白质的测定

(一)方法选择的依据

蛋白质的分析方法很多,可分为两类,一是利用蛋白质中含有一定量的氮,通过测定样品中的含氮量再乘以换算系数,计算出蛋白质的含量,如开氏法;另一类是依据蛋白质的理化性质,测定蛋白质的方法,如染料结合法双缩脲法和萤光法等。最常用的方法是开氏法,但开氏法测定的氮中还包含有氨基酸、酸氨等非蛋白质氮,由此而计算出的蛋白质,故称“粗蛋白质”,如果蛋白质用重金属盐等沉淀分离以后,进行全氮测定,由氮换算而成的蛋白质的含量,则称为“纯蛋白质”。

开氏法是测定全氮量的经典方法,这个方法是丹麦人开道尔于1883年用来研究蛋白质变化的,后来被用于测定各种形态的有机氮。由于设备简单易得,结果可靠,为一般实验室所采用。至今尚没有别的方法能与其比拟或将其取代。因此国际谷物化学协会和美国分析化学家协会以及我国等一些国家都把开氏法作为标准的分析方法。但开氏法也有缺点,主要是操作手续较繁,分析的速度较慢,试剂费用较高。近年,已出现几种以开氏法原理为基础的全自动或半自动的开氏定氮仪,如瑞典的Tecator公司生产的开氏1030分析仪(Kjeltec Auto 1030 Analyzer);日本生产的Kjel-Auto自动氮和蛋白质分析仅和丹麦FOSS公司生产的Kjel-FOSS自动蛋白质分析仪等,这些仪器虽然自动化程度较高,但价钱昂贵,目前尚不能普及。

在生产和科研工作中,为了完成大批样品的分析,需要采用快速、简易的分析方法,例如染料结合法、双缩脲法、水合茚三酮法、亮磺化黄素萤光法、红外光谱法,核磁共振法、以及测定开氏消煮液中按的靛酚蓝法和纳氏比色法。根据一般实验室的条件,这里侧重介绍开氏法和染料结合法。

(二)籽粒中粗蛋白质的测定(开氏法)

1、方法原理

氮是蛋白质中的主要成分,同类植物籽粒中蛋白质的含氮量基本上是固定不变的。因此,可用开氏法消煮定氮,再将测得的含氮值乘以蛋白质换算系数,即得粗蛋白质含量。氮含量换算成蛋白质的系数,一般采用6.25,这是由蛋白质平均含氮16%为根据导出的值,但不同植物籽位中蛋白质的含氮量有差异,故由氮换算为蛋白质的因数也稍有不同。以定量蛋白质为目的的总氮量测定中,开氏法分解时,硝态氮的部分氨化是不可避免的,因此蔬菜类特别是可能含有硝态氮的化合物的样品,须要用水杨酸固定硝态氮化合物,用开氏法测定总氮量,同时用离子电极法测定硝态氮的含量,再从总氮量减去硝态氮量后乘以蛋白质换算系数即得蛋白质含量。

2、仪器及设备

消煮炉或电炉,消煮管100mL或50 mL,半微量定氮装置,半微量滴定管。

3、试剂

(1)硫酸(H2SO4,p≈1.84 g·cm-3,化学纯);

(2)高锰酸钾溶液[(KMnO4)=50g·L-1]:5g高锰酸钾(KMn04,化学纯)溶于水稀释至100 mL;

(3)还原铁粉(Fe,分析纯);过100目筛;

(4)混合催化剂:硫酸钾(K2SO4,化学纯)、硫酸铜(CuSO4·5H20,化学纯)与硒粉(Se,化学纯)100:10:1混合磨细;

(5)氢氧化钠溶液〔c(NaOH)=10mol·L-1]:400g氢氧化钠(NaOH,化学纯)溶于水,冷却后稀释至1L;

(6)硼酸溶液[p(H3B03)=20g·L-1]:20g硼酸(H3803,化学纯)溶于水,稀释至1 L;

(7)混合指示剂:0.1g甲基红0.5g溴甲酚绿溶于100 mL乙醇[ψ(CH3CH2OH)=95 %]中;

(8)盐酸标准溶液[c(HC1=0.01mol·L-1]:吸取浓HCI 8.3mL注入1L水中先配成(HC1)=0.1 mol·L-1盐酸溶液,用标准Na2CO3标定后(GB601-88),准确稀释10倍。

4、操作步骤

(1)样品的消煮:称取烘干样品(过0.25mm筛子)0.3g~0.5g置于50mL或100mL开氏瓶或消煮管中,加入混合催化剂1.8g,加几滴水湿润后,加5 mL浓H2S04,小心轻摇后(最好加塞放置过夜),盖上小漏斗,将消煮管放置在消煮炉或电炉上,开始时用小火加热,当消煮液呈棕色时,提高温度,消煮至溶液呈清亮带浅蓝色时,再加热约10min,取下,冷却至温热时,将消煮液无损地转入100mL容量瓶中,冷却至室温后,定容并放置澄清。

(2)氮的测定:用移液管吸取澄清待测液5.00 mL或10.00 mL放人半微量定氮仪中进行定氮(以下操作同土壤全氮的测定)。同时作空白试验,校正试剂和滴定误差,并做核对试验。

5、结果计算

粗蛋白质%(干基)=(V-Vo) ×c×14×10-3×分取倍数×k ×100÷m

式中:V——样品测定所消耗盐酸标准溶液的体积,mL;

Vo——空白试验所有耗去盐酸标准溶液的体积,mL;

10-3——将mL换算成L的系数;

C——盐酸标准溶液的浓度,mot·L;

14——氮的摩尔质量,g·mol-1;

10-3——针mL换算成L的系数;

分取倍数——100/5或100/10;

M——样品质量,g,干基;

k——氮换算成蛋白质的系数。

参考资料:土壤农业化学分析方法


【关键词】蛋白质,基酸,国家标准物质网 

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