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核酸探针的种类及其制备方法
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-09-29

核酸探针(Nucleic acid prode)是指带有检测标记的已知核苷酸片段,能与互补核苷酸序列退火杂交,并可以被特殊的方法所探知。因此可以用于待测核酸样品中特定基因序列的探测。

核酸分子杂交的基本原理是:具有一定同源性的两条核苷酸单链在一定条件下(适宜的温度及离子强度等),可按碱基互补原则退火形成双链,此杂交过程是高度特异性的。核酸分子杂交发生于两条DNA单链之间者(ssDNA:ssDNA)称。DNA杂交;发生于RNA链与DNA链单链之间者(RNA:ssDNA)称RNA:DNA杂交。因此,如果把一段已知基因(DNA或RNA)的核苷酸序列用合适的标记物(放射性同位素、荧光色素、生物素和地高辛等)标记,当作探针与变性后的单链基因组DNA进行杂交反应,并用合适的方法(如放射自显影技术或免疫组织化学技术)把标记物检测出来,如果两者的碱基完全配对,它们即结合双链,从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列(同源序列或片段);检测不出结合则不含已知序列。该项技术不仅具有特异性、灵敏度高的优点,而且兼备组织化学染色的可见性和定位性,从而能够特异性地显示细胞的DNA或RNA,从分子水平去研究特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系,并可揭示核酸片段中某一特定基因的位置。目前这项技术,已被广泛应用于分子生物学领域。近年来,随着食品微生物检测技术的发展,核酸探针技术已被越来越多地用于食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等食源性病原菌的快速检测。

根据核酸分子探针的来源及其性质可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡核苷酸探针等。

一、基因组DNA探针

这类探针多采用分子克隆从基因文库筛选或用PCR技术扩增制备。由于真核生物基因组中存在高度重复序列,制备探针应尽可能选用基因的编码序列(外显子),避免选用内含子及其他非编码序列,否则将引起非特异性杂交而出现假阳性结果。

二、cDNA探针

cDNA探针是以RNA为模板,在反转录酶的作用下合成的互补DNA,因此它不含有内含子及其他非编码序列,是一种较理想的核酸探针。cDNA探针包括双链cDNA探针和单链DNA探针。双链cDNA探针的制备方法是首先从细胞内分离出mRNA,然后通过逆转录合成cDNA,再通过DNA聚合酶合成双链cDNA分子。将双链cDNA分子插入载体中克隆、筛选、扩增、纯化,然后进行标记即可。单链DNA探针的制备相对来说要简单些,即将cDNA导人M13衍生载体中,产生大量单链jDNA,标记后即成。用单链DNA探针杂交,可克服双链cDNA探针在杂交反应中的两条链之间复性的缺点,使探针与靶mRNA结合的浓度提高,从而提高杂交反应的敏感性。

三、RNA探针

mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想的,其优点是:①RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳定性高,因此杂交反应可以在更为严格的条件下进行(杂交温度可提高100C左右),杂交的特异性更高;②单链RNA分子由于不存在互补双链的竞争陛结合,其与待测核酸序列杂交的效率较高;③RNA中不存在高度重复序列,因此非特异性杂交也较少;④杂交后可用RNase将未杂交的探针分子消化掉,从而使本底降低。但是,大多数mRNA中存在多聚腺苷酸尾,有时会影响其杂交的特异性,此缺点可以通过在杂交液中加入Poly(A),将待测核酸序列中可能存在的Poly(dT)或Poly(u)封闭而加以克服。另外,RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解,因此不易操作也是限制其广泛应用的重要原因之一。事实上,极少使用真正的mRNA作为探针,因为其来源极不方便,一般是通过cDNA克隆,甚至基因克隆经体外转录而得到mRNA样或anti-mRNA样探针。

制备的RNA探针方法是,首先把目的基因cDNA片段插入到含有特异的RNA聚合酶启动子序列的质粒中,再将重组质粒扩增、纯化,用限制酶将质粒模板切割,使之线性化,然后在RNA酶的作用下,从启动子部位开始,以cDNA为模板进行体外转录。在体外转录反应体系中,只要提供有标记的核苷酸原料,经过体外转录后就能获得标记的RNA探针。

四、寡核苷酸探针

采用人工合成的寡聚核苷酸片段作为分子杂交的探针,其优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列,避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响;由于大多数寡核苷酸探针长度只有15~30bp,其中即使有一个碱基不配对也会显著影响其熔解温度(tm),因此它特别适合于基因点突变分析;此外,由于序列的复杂性降低,因此杂交所需时间也较短。需要注意的是,短寡核苷酸探针所带的标记物较少,特别是非放射性标记时,其灵敏度较低,因此当用于单拷贝基因的Southern印迹杂交时,采用较长的探针为好。

寡核苷酸探针是以核苷酸为原料,通过DNA合成仪合成的。合成寡核苷酸探针的长度一般为10~50个核苷酸。如果靶DNA或mRNA的序列是已知的,合成寡核苷酸的序列就很容易确定。如果仅仅知道氨基酸的序列,由于遗传密码的兼并性,一个氨基酸兼有几个密码子编码,如以氨基酸顺序推测核苷酸顺序,则可能与天然基因不完全一致,因此探针的设计就复杂得多。在确定寡核苷酸序列时,一定要使该探针与靶基因序列特异性结合,而与无关序列不产生杂交反应。目前有专门的计算机软件帮助设计合成寡核苷酸探针,可用5’末端标记法、3’末端标记法或引物延伸法标记寡核苷酸探针。

参考资料:现代食品检测技术


【关键词】核酸探针,食品检测国家标准物质网 

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