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食品中氯霉素的三重四极气相色谱-质谱法分析测定
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-11-08

1、适用范围

本方法适用于肉制品、水产品、蜂蜜和乳制品等食品中氯霉素的三重四极气相色谱一质谱联用法(GC_MS—MS)定性、内标法定量检测。

本方法检出限和定量限分别为O.1μg/kg和O.3μg/kg。

2、原理

样品经乙酸乙酯提取,硅烷化衍生后采用三重四极气相色谱-质谱法进行多反应监测模式(MRM)检测,内标法定量。

3、仪器与试剂

(1)仪器:三重四极气相色谱-质谱联用仪,配自动进样器;均质机;漩涡混匀器;氮气吹干仪;离心机;恒温干燥箱。

(2)试剂:乙酸乙酯(色谱纯);甲苯(色谱纯);正己烷(色谱纯);正庚烷(色谱纯);衍生试剂,双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)99%+三甲基氯硅烷(TMCS)1%。

(3)标准品:氯霉素标准品、D5一氯霉素标准品。

①标准储备液配制:准确称取氯霉素标准10.0mg,用甲醇溶解并定容至10mL,得到1mg/mL氯霉素标准储备液,存放在冰箱中备用。

准确称取D5-氯霉素标准1.0mg,用甲醇溶解并定容至10mL,得到0.1mg/mL D5-氯霉素标准储备液,存放在-18℃冰箱中备用。

②标准使用液配制:氯霉素标准使用液250ng/mL,由1mg/mL的储备液临用前逐级用甲醇稀释得到250ng/mL,于4℃冰箱中保存,有效期7d。

D5-氯霉素同位素内标使用液50ng/mL,由O.1mg/mL的储备液逐级用甲醇稀释得到50ng/mL内标使用液,于4℃冰箱中保存。

4、分析步骤·

(1)试样的制备与保存

①肉制品和水产品:肉制品和水产品去骨后用搅肉机搅碎并混合均匀,按法取样后测定,留样密封,做好标记后于-18℃冷冻保存。

②蜂蜜和乳制品:对无结晶的样品,将其搅拌均匀。对有结晶的样品,在密闭情况下,置于不超过60℃的水浴中温热,振荡,待样品全部融化后搅匀,迅速冷却至室温。按法取样后测定,留样密封,并做上标记于-18℃冷冻保存。

(2)样品提取:

①肉制品和水产品:称取4g(精确至O.01g)绞碎的样品,加1.0μL内标使用液,20mL乙酸乙酯,均质,离心,取上清液10mL,50℃氮气吹干溶剂后,加入O.5mL甲醇溶解残渣,再加4mL的1m01/L NaCl溶液,混匀后加2mL×2的正已烷脱脂,最后用3mL、2mL乙酸乙酯分别萃取水相,离心后取乙酸乙酯层,合并用氮气吹千。

②蜂蜜和乳制品:称取4g(精确至O.01g)混匀的样品,加100uL内标使用液、5mL水、20mL乙酸乙酯,混匀后室温超声提取5min,离心,取上清液10mL,50℃氮气吹干溶剂后,加入O.5mL甲醇溶解残渣,再加4mL的1mol/L NaCl溶液,混匀后加2mL×2的正己烷脱脂,最后用3mL、2mL乙酸乙酯分别萃取水相,离心后取乙酸乙酯层,合并用氮气吹干。

(3)样品净化:由于气相色谱-串联质谱法的选择性较高,基体干扰较少,样品经上述液液分配净化后可以直接硅烷化后进行筛选。对于有干扰或者阳性的样品,可以按下述方法固相萃取净化。

①硅胶柱的活化,依次用5mL的乙腈和二氯甲烷淋洗活化。

②上述处理后的残渣用1mL二氯甲烷溶解,并定量上样于活化后的硅胶柱中。

③用10mL二氯甲烷淋洗,并弃去。用10mL乙酸乙酯洗脱,并收集洗脱液,氮气吹干待衍生化后测定。

(4)衍生化:取上述吹干后的残渣加入10μL衍生剂BSTFA 99%+TMCS 1%,涡旋混合1min,在70℃烘箱中加热30min,氮气吹干,加入100μL正庚烷,涡旋混合lmin,转移至带有100μL玻璃插管的样品瓶中,进行GC/MS/MS分析。

分别取250ng/mL氯霉素使用液2μL、4μL、10μL、20μL、40μL、100μL于3mL玻璃离心管中作为标准系列,相当于测定液中氯霉素的质量分别为O.5ng、1ng、2.5ng、5ng、10ng、25ng;

分别取100μL 50ng/mL D5-氯霉素使用液加入上述氯霉素标准系列中,氮气吹干,加入100μL衍生剂BSTFA 99%+TMCS 1%,涡旋混合lmin,在70℃烘箱中加热30min,氮气吹干,加入100μL正庚烷,涡旋混合1min,转移至带有100μL玻璃插管的样品瓶中,进行Gc/MS/MS分析。

(5)样品测定:

①气相色谱参考条件:色谱柱,DB-5MS石英毛细管色谱柱或相当者(30m×O.25mm×0.25μm);色谱柱升温程序,100℃保持1min,以15℃/min升温到240℃,保持5min,再以lO℃/min升温到270℃,保持5min;进样口温度250℃;进样体积1μL;进样模式,不分流进样;传输线温度280℃;载气,高纯氦气99.999%,恒流模式,流速为1.OmL/min。

②质谱分D5-氯霉素的分析参数见表3—16,氯霉素衍生物全扫描质谱图见图3—19。

5、结果计算

样品中氯霉素的含量可由工作站计算机按内标法自动计算,以标准品中氯霉素衍生物m/z 225→208的峰面积与D5-氯霉素衍生物m/z 230→213的峰面积比值对氯霉素质量(ng)进行线性回归计算,再按下式(3—3—2)计算样品中氯霉素的含量:

                           (3-3-2)

式中:X——测试样品中氯霉素的含量(μg/kg);

c——由工作站内标法计算出的样品测定液中氯霉素的质量(ng);

m——样品称取质量(g)。

6、质量控制

(1)在欧盟委员会有关兽药产品法规EC508/1999中,氯霉素属于附录4中“不得检出、禁用化合物”,规定其确认最少需要4个识别点,在2002/657/EC有关兽药分析方法决议中规定,分析方法必须能提供化学结构信息,色谱结合质谱分析,确立了气相色谱-质谱和液相色谱-质谱的“点系统”,本方法选择一个母离子,两个子离子,共得4个识别点,满足法规要求,对阳性样品提供了有效的识别点,有效降低了化学背景干扰,提高了分析灵敏度。保留时间定性时间窗口一般为O.02min。

(2)同时为了保证分析结果的准确,要求在分析每批样品时,取空白样品进行1.Oμg/kg加标,计算添加回收率,添加回收率应在60%~120%范围之内。要求同位素内标物的绝对回收率>30%,不符合时需重新称样检测。

参考资料:气相色谱-质谱在仪器安全监测中的应用


【关键词】氯霉素,三重四极,气相色谱-质谱,国家标准物质网 

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