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志贺氏菌参考检验方法(二)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-12-07

(八)SS琼脂

1、基础培养基

成分:牛肉膏5g,脉胨5g,三号胆盐3.5g,琼脂17g,蒸馏水1000mL。

制法:将牛肉膏、脲胨和胆盐溶解于400mI,蒸馏水中,将琼脂加入于600mL蒸馏水中,煮沸,使其溶解,再将两液混合,121℃高压灭菌15min,保存备用。

2、完全培养基

成分:基础培养基1000mL,

乳糖10g,柠檬酸钠8.5g,硫代硫酸钠8.5g,10%柠檬酸铁溶液10mL,1%中性红溶液2.5mL,O.1%煌绿溶液O.33mL。

制法:加热溶化基础培养基,按比例加入上述染料以外的各成分,充分混合均匀,校正pH至7.0,加入中性红和煌绿溶液,倾注平板。

注:①制好的培养基宜当日使用,或保存冰箱内于48h内使用。

②煌绿溶液配好后应在lOd以内使用。

③可以购用SS琼脂的干燥培养基。

(九)三糖铁琼脂

成分:蛋白胨20g,牛肉膏5g,乳糖lOg,蔗糖lOg,葡萄糖1g,氯化钠5g,硫酸亚铁铵(Fe(NH4)2(SO4)2·6H20]0.2g,硫代硫酸钠0.2g,琼脂12g,酚红0.025g,蒸馏水1000mL,pH7.4。

制法:将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中,校正pH,加入琼脂煮沸溶化,加入0.2%酚红水溶液12.5mL,摇匀,分装试管,121℃高压灭菌15min,放置高层斜面备用。

(十)蛋白胨水(靛基质试验用)

成分:蛋白胨(或胰蛋白胨)20g,氯化钠5g,蒸馏水1000mL,pH7.4。

制法:按上述成分配制,分装小试管,121℃高压灭菌15min。

靛基质试剂:

柯凡克试剂:将5g对二甲氨基苯甲醛溶于75mL戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25mL。

欧-波试剂:将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%酒精内,然后缓慢加入浓盐酸20mL。

试验方法:接种培养物36±1℃培养1~2d,加柯凡克试剂约0.5 mL,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色。或加欧一波试剂约0.5mL,沿管壁流下覆盖于培养基表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。

注:蛋白胨中应含有丰富的色氨酸,每批蛋白胨应先用已知菌种鉴定后方可使用。

(十一)尿素琼脂(pH7.2)

成分:蛋白胨1g,氯化钠1g,葡萄糖5g,磷酸二氢钾1g,O.4%酚红溶液2g,琼脂3mL,蒸馏水20g,20%尿素溶液1000mL,pH7.2。

制法:将除尿素和琼脂以外的成分配好,校正pH,加入琼脂煮沸溶化,分装烧瓶,1210C高压灭菌15min,冷至50~55℃加入经除菌过滤的尿素溶液,分装于灭菌试管内,放成斜面备用。

试验方法:接种培养物36±1℃培养24h,观察结果,尿素酶阳性者,由于产碱而使培养基变为红色。

(十二)氰化钾(KCN)培养基

成分:蛋白胨1g,氯化钠5g,磷酸二氢钾0.225g,磷酸氢二钠5.64g,蒸馏水1000mL,O.5%氰化钾溶液20mL,pH7.6。

制法:将除氰化钾以外的成分配好,分装烧瓶,121℃高压灭菌15min,放在冰箱内使其充分冷却,每100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2mL(最后浓度为1:10000),分装灭菌试管,每管约4mL,立刻用灭菌橡皮塞塞紧,放4℃冰箱保存,同时将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。

(十三)氨基酸脱羧酶试验培养基

成分:蛋白胨5g,酵母浸膏3g,葡萄糖1g,蒸馏水1000mL,1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,L-氨基酸或DL氨基酸0.5或1g/100mL。

制法:除氨基酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100mL,分别加入各种氨基酸:赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入,DL-氨基酸按1%加入,校正pH至6.8,对照培养基不加氨基酸,分装于灭菌的小试管内,每管0.5mL,上面加一层液体石蜡,115℃高压灭菌10min。

试验方法:接种培养物于36±1℃培养18-24h,观察结果,氨基酸脱羧酶阳性者,由于产碱培养基应呈紫色,阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色,对照管应为黄色。

(十四)糖发酵管

成分:牛肉膏5g,蛋白胨lOg,氯化钠3g,磷酸氢二钠2g,0.2%溴麝香草酚蓝溶液12mL,蒸馏水1000mL,pH7.4。

制法:葡萄糖发酵管按上述成分配好后,按0.5%加入葡萄糖,分装于有倒管的试管内,121℃高压灭菌15min。其他各种糖发酵管,可按上述成分配好后分装每瓶100 mL,1210C高压灭菌15 min,另将各种糖类分别配成10%溶液,同时高压灭菌,将5mL糖溶液加入于100mL培养基内,以无菌操作分装小试管。

注:蔗糖不纯,加热后会自行水解者,应采用过滤法除菌。

(十五)ONPG培养基

成分:邻硝基酚β-D半乳糖苷(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside ONPG) 60mg,0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pFl7.5) 10mL,1%蛋白胨水(pI-17.5) 30mL。

制法:将ONPG溶于缓冲液内,加入蛋白胨水,以过滤法除菌,分装试管,每管O.5mL,用橡皮塞塞紧。

试验方法:由琼脂斜面上挑取培养物1满环接种,于361℃培养1~3h或24h观察结果,如果β-半乳糖苷酶产生,则于1-3h变黄色,如无此酶则24h不变色。

(十六)半固体琼脂

成分:蛋白胨lg,牛肉膏0.3g,氯化钠O.5g,琼脂O.35~0.4g,蒸馏水100mL。

制法:按上述成分配好,煮沸溶解,校pH为7.4,分装小试管,1210C高压灭菌15min,直立凝固备用。

(十七)缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和V-P试验用)

成分:磷酸氢二钾5g,多胨7g,葡萄糖5g,蒸馏水1000mL,pH7.O。

制法:溶化后校iE pH,分装试管,每管1-2mL,1210C高压灭菌15min。

甲基红试验:接种培养物于36±1℃培养2-4天,滴加试剂一滴,立即观察结果,鲜红色为阳性,黄色为阴性。

甲基红试剂配法:10mg甲基红溶于30mL,乙醇中,然后加入20mL蒸馏水。

V—P试验:接种培养物予36±1℃培养2~4天,加入6%α-萘酚酒精溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL,充分振摇观察结果,阳性者立刻或数分钟呈红色,如阴性时应于36℃培养4h再进行观察。

(十八)丙二酸钠培养基

成分:酵母膏1g,硫酸铵2g,磷酸氢二钾0.6g,磷酸二氢钾0.4g,氯化钠2g,丙二酸钠3g,0.2%溴麝香草酚蓝溶液12mL,蒸馏水1000mL,pH6.8。

制法:先将酵母浸膏和盐类溶解于水,校正pH后再加指示剂,分装试管,121℃高压灭菌15min。

接种培养物于36±1℃培养48h,阳性者由绿色变为蓝色。

(十九)氧化酶试验

1%盐酸二甲基对苯二胺溶液:小量新鲜配制,于冰箱内避光保存。

1%α-萘酚乙醇溶液。

试验方法:取白色洁净滤纸沾取菌落,加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴,阳性者呈现粉红色,并逐渐加深,再加α-萘酚溶液一滴,阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色,阴性于2min内不变。

以毛细吸管吸取试剂,直接滴加于菌落上,其显色反应与以上相同。

(二十)WS琼脂

成分:

豚胨12g,牛肉膏3g,氯化钠5g,乳糖12g,蔗糖12g,十二烷基硫酸钠2g,琼脂15g,Andrade指示剂20mL,O.4%溴麝香草酚蓝溶液16mL,甲液20mL,蒸馏水1000mL,pH7.0。

制法:

除指示剂和甲液外,将其他成分加热溶解,不需消毒,校正pH后加入指示剂和甲液,倾注平板,应呈草绿色。

注:①供沙门氏菌分离用。

②Andrade指示剂和甲液的配制均见HE琼脂。

参考资料:食品卫生微生物检验标准手册

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志贺氏菌参考检验方法(一)


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