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赭曲霉毒素A标准检测方法(一)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-12-10

赭曲霉毒素(Ochratoxins)是由曲霉属和青霉属的几个种产生的有毒代谢产物。在寒冷的气候下,产毒霉菌主要是纯绿青霉(P.uiridicatum),而在温暖的气候下,产毒霉菌主要是赭曲霉(A.ochracatum)。赭曲霉毒素的基本化学结构是由异香豆素连接到p-苯基丙氨酸上的衍生物,有A、B、C、D四种化合物。赭曲霉毒素A(0chratoxin A.缩写OTA)的化学结构式为:

赭曲霉毒素B的分子结构中没有氯元素,赭曲霉毒素c是赭曲霉:荤素A的乙酯,赭曲霉毒素D是4-羟基赭曲霉毒素A。从对谷物的污染率、污染水平及对人畜的毒性考虑,OTA是重要的有卫生学意义的霉菌代谢产物。OTA是稳定的无色结晶化合物,溶于极性溶剂和稀碳酸氢钠溶液,微溶于水。将0TA的乙醇溶液贮于冰箱中一年以上也无损失,但应避光保存,如接触紫外线,几天就会分解。

OTA主要污染谷物和大豆,在动物饲料中OTA的污染率和污染水平远远超过供人食用的粮食。动物食用污染OTA的饲料,OTA蓄积于动物体内,在动物的肾、肝、肌肉和血液中都能检出OTA,人也可通过食用动物组织摄入OTA。OTA对实验动物的毒性主要表现为肾脏毒和肝脏毒,并有致畸和致癌作用。由OTA引起的天然发生的霉菌毒素病有丹麦和瑞典猪的霉菌毒素肾病,OTA也可能是巴尔干地区流行的人的地方性肾病的病因。世界粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会在第37次(1991年)报告中对OTA的毒性进行了评价,认为猪是最敏感的动物,肾是OTA作用的主要靶器官。应用对猪进行90d喂养试验的结果,评价人的OTA允许摄入量,用最低有作用水平每天0.0008 mg/kg体重和500倍的安全系数,在此基础上建立了每星期112μg/kg体重的暂时允许摄入量。我国还没有制定出OTA的卫生标准。据文献报导,食品(包括谷物、动物组织)中OTA的检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法和酶联免疫吸附测定法。

一、薄层色谱法

(一)适用范围

本方法适用于小麦、玉米和大豆中OTA的测定。

(二)原理

用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇/水提取样品中的OTA,样品提取液经液-液分配后,根据其在波长365nm紫外光灯下产生黄绿色荧光,在薄层色谱板上与标准比较测定含量。

(三)试剂

以下试剂除特殊规定外均为分析纯试剂,水为蒸馏水或同等纯度的水。

1、石油醚(60~900C或30~60℃);

2、甲醇;

3、三氯甲烷;

4、甲苯;

5、乙酸乙酯;

6、甲酸;

7、冰乙酸;

8、乙醚;

9、苯-乙腈(98+2);

10、0.1mol/L磷酸[c(H3PO4)=0.1mol/L]:称取11.5g磷酸(85%磷酸),加水稀释至1000mL;

11、2mol/L盐酸溶液[c(HCl)=2mol/L]:量取20mL盐酸,加水稀释至120mL;

12、4%氯化钠溶液;

13、0.1mol/L碳酸氢钠溶液[c(NaHCO3)=0.1mol/L]:称取8.4g碳酸氢钠,加适量水溶解,并用水稀释至1000mL;

14、硅胶G;

15、赭曲霉毒素A标准溶液:用苯-冰乙酸(99+1)配成40μg/mLOTA贮备液,并用紫外分光光度计测定其浓度。最大吸收峰波长333nm,分子量403,摩尔消光系数值为5550)。精密吸取贮备液,用苯稀释成每毫升含OTAO.5μg。OTA标准溶液应置冰箱中避光保存。

(四)仪器

所有玻璃仪器均需用稀盐酸浸泡,依次用自来水、蒸馏水冲洗。

1、小型粉碎机;

2、电动振荡器;

3、玻璃板:5cm×20cm;

4、薄层涂布器:0.3mm;

5、展开槽:内长25cm,宽6cm,高4cm;

6、紫外光灯:波长365nm;

7、微量注射器:10μL,50μL;

8、具O.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。

(五)操作步骤

1、样品溶液的制备

用法:称取20g粉碎并通过20目筛的样品,置于200mL具塞锥形瓶中,加入10O mL三氯甲烷和10mL O.1mol/L磷酸,振荡30min后通过快速定性滤纸过滤。取20mL滤液置于250mL分液漏斗中,加50mL,0.1mol/L碳酸氢钠溶液振摇2min,静置分层后,将三氯甲烷层放入另一个100mL分液漏斗中(少量乳化层或即使三氯甲烷层全部乳化都可放入分液漏斗中),加入50 mL0.1mol/L碳酸氢钠溶液,重复提取三氯甲烷层,静置分层后弃去三氯甲烷层(如三氯甲烷层仍乳化,弃去,不影响结果)。碳酸氢钠水层并入第一个分液漏斗中,加约5.5 mL2 mol/L盐酸溶液调节pH2~3(用pH试纸测试),加入25mL三氯甲烷振摇2min,静置分层后,放三氯甲烷层于另一盛有100mL水的250mL分液漏斗中,酸水层再用10mL三氯甲烷振摇提取、静置,将三氯甲烷层并入同一分液漏斗中,振摇、静置分层,用脱脂棉擦干分液漏斗下端,放三氯甲烷层于一75mL蒸发皿中,将蒸发皿置蒸气浴上通风挥干,用约8mL三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解,转入具尾管的10mL浓缩瓶中,置80tC水溶锅上用蒸气加热吹氮气浓缩至干,加入0.2mL苯-乙腈(98+2)溶解残渣,摇匀,供薄层色谱点样用。

参考资料:食品卫生微生物检验标准手册


【关键词】赭曲霉毒素,食品卫生,微生物,国家标准物质网 

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