点击接通在线客服
赭曲霉毒素A标准检测方法(二)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-12-11

乙法:称取20g粉碎并通过20目筛的样品,加于200mL具塞锥形瓶中,加30mL石油醚和100mL甲醇-水(55+45),在瓶塞上抹一层水盖严防漏。振荡30min后,通过快速定性滤纸滤入分液漏斗中,待下层甲醇水层分清后,取出20mL滤液,置于100mL分液漏斗中,用pH试纸测试,一般为5~6。加入25mL三氯甲烷振摇2min,静置分层后放出三氯甲烷层于另一个分液漏斗中,再用10mL三氯甲烷重复振摇提取甲醇水层(在用三氯甲烷振摇提取时,如发生乳化现象,可滴加甲醇促使其分层),将三氯甲烷层合并于同一分液漏斗中,加入50~100mL4%氯化钠溶液(加入量视品种不同而异,大豆加100mL,小麦、玉米则加50mL左右),振摇放置(如为大豆样品,还须轻轻反复倒转分液漏斗,使乳化层逐渐上升。如乳化严重,可加入少许甲醇),待三氯甲烷层澄清后,用脱脂棉擦干分液漏斗下端,放三氯甲烷层于75mL蒸发皿中(如为大豆样品,须再加入10mL三氯甲烷振摇,三氯甲烷层合并于同一蒸发皿中),将蒸发皿置蒸气浴上通风挥干。以下操作自“用约8mL三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解”起,按甲法操作。

2、薄层色谱测定

(1)薄层板的制备:称取4g硅胶G,加约10mL水于乳钵中研磨至糊状,立即倒入涂布器内,制成5cm×20cm、厚度O.3min的薄层板三块,在空气中干燥后,在105~110℃活化1h,取出放干燥器中保存。

(2)点样:取两块薄层板,在距薄层板下端2.5cm的基线上用微量注射器滴加两个点。在距板左边缘1.7cm处滴加0TA标准溶液8μL(浓度O.5μg/mL),在距板左边缘2.5cm处滴加样液25μL,然后在第二块板的样液点上加滴0TA标准溶液8μL(浓度O.5μg/mL)。

(3)展开

①展开剂

横展剂:乙醚或乙醚-甲醇-水(94+5+1)。

纵展剂:甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(6+3+1.2+O.06)或甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6+3+1.4),苯-冰乙酸(9+1)。

②横向展开:在展开槽内倒入10mL横展剂,先将薄层板纵展至离原点2~3cm,取出通风挥发溶剂l~2 min后,再将该薄层板靠标准点的长边置于同一展开槽内的溶剂中横展,如横展剂不够,可添加适量,展至板端过1min,取出通风挥发溶剂2~3min。

③纵向展开:在另一展开槽内倒入lOmL纵展剂,将经横展后的薄层板纵展至前沿距原点13~15cm。取出,通风挥干至板面无酸味(约5~10min)。

(4)观察与评定:将薄层色谱板置波长365nm紫外光灯下观察。

①在紫外光灯下将两板相互比较,若第二块板的样液点在OTA标准点的相应处出现最低检出量,而在第一块板相同位置上未出现荧光点,则样品中的OTA含量在测定方法的灵敏度10μg/kg以下。

②如果第一板样液点在与第二板样液点相同位置上出现荧光点,则看第二板样液的荧光点是否与滴加的标准荧光点重叠,再进行以下的定量与确证试验。

(5)稀释定量

比较样液中OTA与标准OTA的荧光强度,估计稀释倍数。经稀释后测定含量时,可在样液点的左边基线上滴加二个标准点,0TA的量可为4ng、8ng。比较样液与两个标准OTA荧光点的荧光强度,概略定量。

(6)确证试验:用碳酸氢钠乙醇溶液(在100mL水中溶解6.0g碳酸氢钠,加20mL乙醇)喷洒薄层色谱板,在室温下干燥,于长波紫外光灯下观察,这时OTA荧光点应由黄绿色变为蓝色,而且荧光强度有所增加,再估计样品中OTA,如果与喷洒前情况不一致,要利用喷洒前所做的估计。

(7)计算

                      

式中:X——样品中0TA的含量,μg/kg;

A——薄层板上测得样液点上OTA的量,μg;

D——样液的总稀释倍数;

V1——苯-乙腈混合液的体积,mL;

V2——出现最低荧光点时滴加样液的体积,mL;

m——苯-乙腈溶解时相当样品的质量,g。

(六)注意事项

1、空气湿度影响薄层板分离效果,可根据板面分离情况决定纵展剂中是否加水。

2、如果将薄层板直接进行横展,当样品中OTA含量高时,OTA的荧光点会被横向拉长,使点变扁,或分成两个黄绿色荧光点。这是因为在横展过程中原点上样品的量超过了硅胶的吸附能力,原点上的杂质和残留溶剂在横展中将OTA点横向拉长了,这时可根据OTA黄绿色荧光的总强度与标准荧光强度比较,估计需减少的滴加微升数或所需稀释倍数。在本方法中,先将薄层板纵展一短距离后再横展,避免了上述现象的发生。

3、OTA的标准使用液应避光,用黑纸遮光。

4、在薄层板上OTA的最低检出量为4μg,本方法的最低检测量为10μg/kg。

5、本方法经五个协作者验证,当小麦、玉米中OTA加入量分别为10、50、100μg/kg水平、每个水平n=2时,方法的回收率用X表示,精密度用SD表示:

小麦分别为93±10.23、92±14.72、105±38.85;

玉米分别为88±9.68、88±9.68、103±41.2。

[上述数据为(X±SD)%]。

二、酶联免疫吸附测定法

用赭曲霉毒素A作为半抗原,与牛血清白蛋白(BSA)或人γ球蛋白结合,制成复合抗原;免疫动物,产生特异性的抗血清或单克隆抗体,并建立起酶联免疫吸附测定法。Candlish等人1986年首次报道了抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体。卫生部食品卫生监督检验所也已制备出高特异性的抗赭曲霉毒素单克隆抗体,建立了直接竞争性酶联免疫吸附测定法(直接法)和间接竞争性酶联免疫吸附测定法(间接法)。

(一)直接法

1、原理:将已知抗原吸附在固相载体表面,洗除未吸附的抗原,加入一定量的酶标记抗体与样品(含有抗原)提取液的混合液,竞争温育后,在固相载体表面形成抗原-抗体-酶复合物。洗除多余部分,加入酶的底物。在酶的催化作用下,底物发生降解反应,产生有色物质。通过酶标检测仪,测出酶底物的降解量,从而推知被测样品中的抗原量。

参考资料:食品卫生微生物检验标准手册

相关链接:

赫曲霉毒素A标准检测方法(一)


【关键词】赭曲霉毒素,食品卫生,微生物,国家标准物质网 

<< 上一篇:AA 240 DUO原子吸收光谱仪(四)

>> 下一篇:食品中有害元素的测定之铝(二)