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赭曲霉毒素A标准检测方法(三)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-12-12

2、试剂

(1)化学药品:赭曲霉毒素A,四甲基联苯胺,甲醇,石油醚,三氯甲烷,无水乙醇,乙酸乙酯,二甲基甲酰胺,吐温-20,30%过氧化氢等。

(2)缓冲液系统

包被缓冲液:50mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液,pH9.6;

洗液:含O.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液,pH7.4;

样品与标准毒素稀释液:含20%甲醇的洗液;

底物缓冲液:0.1mol/L的磷酸一柠檬酸缓冲液,pH5.O;

底物溶液:取50μL四甲基联苯胺溶液,加10mL底物缓冲液、10μL30%过氧化氢,混合均匀。

终止液:1mol/L硫酸溶液。

(3)赭曲霉毒素A标准溶液:用甲醇配成1mg/mL赭曲霉素人贮备液,-200C冰箱贮存。于检测当天,精密吸取贮备液,用稀释液稀释成制备标准曲线所需浓度。

(4)包被抗原:赭曲霉毒素A与载体蛋白——牛血清白蛋白的结合物。

(5)抗体:抗赭曲霉毒素A单克隆抗体与辣根过氧化酶结合物。

3、测定方法

(1)提取与净化:称取20g粉碎样品,置200mL具塞锥形瓶中,加入30mL石油醚和100mL甲醇-水(55+45),在瓶塞上抹一层水盖严防漏。振荡30min后,通过快速定性滤纸滤入分液漏斗中,待下层甲醇水层分清后,取出20mL滤液,置于100mL分液漏斗中,用pH试纸测试,一般为5~6。加入25mL三氯甲烷振摇2 min,静置分层后放出三氯甲烷层于另一分液漏斗中,再用10mL三氯甲烷重复振摇提取甲醇一水层,将三氯甲烷层合并于同一分液漏斗中,加入50~100mL4%氯化钠溶液,振摇放置,待三氯甲烷层澄清后,用脱脂棉擦干分液漏斗下端,放三氢甲烷层于蒸发皿中,将蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干。用约8mL三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解,转入具尾管的10mL浓缩瓶中,置80℃水浴锅上浓缩至干,加O.5mL的稀释液溶解残渣,摇匀,供本法加样之用。

(2)具体步骤:用包被抗原(10μg/mL)包被酶标板,每孔lOOμL,4℃过夜;

酶标板用洗液洗3次,每次3min后,加入不同浓度的赭曲霉素A标准溶液(制作标准曲线)或样品提取液(检测样品毒素含量)与抗体一酶结合物溶液(1:400)的混合液(1:1,每孔100μL,该混合液应于使用的前一天配好,4℃过夜备用),置37℃1.5h;

酶标板洗3次,每次3min后,加入底物溶液。每孔100μL,37℃30min。

用终止液终止反应,每孔50μL,于波长450 nm处测定OD值。

(3)结果判定:若样品检测孔所测得()D值大于(或等于)阳性对照孔0D值,该样品为阴性;反之,则为阳性。阳性样品毒素含量可根据下列公式计算。

          

式中:C——酶标板上所测得的赭曲霉毒素A的量,ng,根据标准曲线求得;

V1——样品提取液的体积,mL;

V2——滴加样液的体积,mL;

D——样液的总稀释倍数;

M——样品质量,g。

(二)间接法

1、原理

将已知抗原吸附在固相载体表面,洗除未吸附抗原,加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液,竞争温育后,在固相载体表面形成抗原抗体复合物。洗除多余抗体成分,然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物,与吸附在固体表面的抗原一抗体复合物相结合,再加入酶的底物。在酶的催化作用下,底物发生降解反应,产生有色产物,通过酶标检测仪,测出酶底物的降解量,从而推知被测样品中的抗原量。

2、试剂

(1)化学药品:同直接法。

(2)缓冲液系统:同直接法。

(3)赭曲霉毒素A标准溶液:同直接法。

(4)包被抗原:同直接法。

(5)抗体:抗赭曲霉毒素A单克隆抗体。

(6)酶标二抗:免抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物。

3、测定方法

(1)提取与净化:同直接法。

(2)具体步骤:用包被抗原(10μg/mL)包被酶标板,每孔100μL,4℃过夜;

酶标板用洗液洗3次,每次3 min后,加入不同浓度的赭曲霉毒素A标准溶液(制作标准曲线)或样品提取液(检测样品中的毒素含量)与抗体溶液(1:20 000)的混合液(1:1,每孔lOOμL,该混合液应于使用的前一天配好,4C过夜备用),置37lClh;

酶标板洗3次,每次3min后,加入酶标二抗,每孔100μL,37℃,1.5h;

同上述洗涤后,加入底物溶液,每孔lOOμL,37℃,30 min;

用终止液终止反应,每孔50μL,于波长450nm处测定OD值。

(3)结果判定:同直接法。

参考资料:食品卫生微生物检验标准手册

相关链接:

赫曲霉毒素A标准检测方法(一)

赫曲霉毒素A标准检测方法(二)


【关键词】赭曲霉毒素,食品卫生,微生物,国家标准物质网 

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