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牛、猪组织中头孢噻呋残留检测方法——高效液相色谱法
【来源/作者】周世华 【更新日期】2017-01-01

1、安全要求

实验操作时穿工作服、戴口罩和手套;提取和净化操作都应在通风橱中进行,避免溶剂气体吸人和皮肤接触;废弃的化学试剂收集到专用容器中集中处理。

2、急救措施

皮肤接触到有机溶剂或酸、碱溶液后用清水清洗,有机溶剂或酸、碱溶液溅入眼中用清水灌洗。

3、适用范围

该标准操作规程适用于猪、牛的肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中头孢噻呋残留量检测。

4、职责

进行该项检验的检验员必须按该标准操作规程进行检验,质量监督员负责监督该标准操作规程的正确执行。

5、检测原理

试料中残留的头孢噻呋,用二硫赤藓醇(DTE)溶液提取,使头孢噻呋及去呋喃甲酰头孢噻呋(DFC)有关代谢物从蛋白或含硫化合物中分离,产生DFC。DFC与碘乙酰胺反应,生成稳定的DFC乙酰胺衍生物(DCA),原形药或代谢物均转化为DCA衍生物。用C18固相萃取柱对衍生物进行提取。强阴离子交换SAX)柱纯化,再用强阳离子交换(SCX)柱净化。DCA衍生物用高效液相色谱一紫外法测定,外标法定量。

6、方法灵敏度

本方法在牛肝脏组织中的定量限为500μg/kg,其他组织的定量限为100μg/kg。

7、注意事项

除特别说明外,淋洗和洗脱过程中应避免萃取柱柱床干涸。

8、材料、仪器、试剂的准备及基本要求

除特别注明外,以下所用试剂均为分析纯;水为符合GB/T6682规定的一级水。

8.1对照品、试剂和药物储备液、工作液准备

8.1.1头孢噻呋标准品以C19H17N5O7S3计,含量≥87.5%

8.1.2二硫赤藓醇(DTE) 99%

8.1.3磷酸85%

8.1.4氯化钾

8.1.5氢氧化钾

8.1.6硼酸钾

8.1.7氯化钠

8.1.8碘乙酰胺97%

8.1.9无水氯化钙

8.1.10磷酸二氢钾

8.1.11冰醋酸

8.1.12氢氧化钠

8.1.13三氟乙酸(TFA) 99%

8.1.14乙腈色谱纯

8.1.15甲醇色谱纯

8.1.16 0.05M硼酸缓冲液(pH值约为9) 称取硼酸19g和KCl 3.7g,加水溶解并稀释至1000mL。

8.1.17 0.025M磷酸盐缓冲液(pH值7) 称取KH2PO43.4g,加水溶解并稀释至1000

mL。用45%KOH溶液调pH值至7。

8.1.18提取液(0.4%) 将lg DTE溶于250mL硼酸缓冲液中,每天制备。

8.1.19碘乙酰胺溶液(14%) 将7g碘乙酰胺溶于50mL磷酸盐缓冲液中,每天制备。

8.1.20 0.01M NaOH溶液 取NaOH饱和溶液0.52mL,加水稀释至1000mL。

8.1.21 0.1M氯化钠溶液 称取NaCl 5.9g,加水溶解并稀释至1000mL。

8.1.22 0.1M CaCl2溶液 称取CaCl2 11.1g,加水溶解并稀释至1000mL。

8.1.23 25%磷酸溶液 取磷酸25mL,加水稀释至100mL。

8.1.24 5%醋酸溶液 取醋酸5mL,加水稀释至100mL。

8.1.25 C18柱洗脱液 乙腈:水(15:85)

8.1.26 SAX柱预洗液 甲醇:0.1M NaCl溶液(25:75)

8.1.27 SAX柱洗脱液 乙腈:5%醋酸溶液(5:95)

8.1.28 SCX柱预洗液 甲醇:0.1M CaCl2溶液(25:75)

8.1.29 SCX柱洗脱液 乙腈:0.1M NaCl溶液(5:95)

8.1.30 氢氧化钾溶液(45%) 称取KOH 45g,加水溶解并稀释至100mL。

8.1.31 HPLC流动相

流动相A(0.1%TFA水溶液) 取lmL三氟乙酸,加水至1000mL。

流动相B(0.1%TFA乙腈溶液) 取1mL三氟乙酸,加乙腈至1000mL。

8.1.32头孢噻呋标准储备液(100μg/mL)

准确称量约11.2mg盐酸头孢噻呋标准品,于100mL量瓶中,用0.025M磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度,配成浓度为100μg/mL的贮备液。将贮备液移至冷藏安全瓶中,在一20%贮藏,有效期6个月。

8.1.33头孢噻呋标准工作液(10.0μg /mL)

取5mL头孢噻呋标准储备液,于50mL量瓶中,用0.025M磷酸盐缓冲液稀释至刻度,即得。

8.1.34系列浓度标准工作溶液的制备

分别精密吸取100μg/mL头孢噻呋标准工作液0.06mL、0.5mL、1.0mL、3.0mL、6.0mL、10.0mL至10mL容量瓶中,用0.025M磷酸盐缓冲液稀释至刻度,配成0.06μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、3.0μg/mL、6.0μg/mL、10.0μg /mL的系列工作液。

8.2仪器和设备

8.2.1 高效液相色谱仪(配紫外检测器)

8.2.2组织匀浆机

8.2.3分析天平感量0.000 01g

8.2.4天平 感量0.01g

8.2.5涡旋混合器

8.2.6恒温水浴振荡器

8.2.7高速离心机

8.2.8酸度计

8.2.9离心管 50mL

8.2.10 c1 8固相萃取柱l g/6mL Varian BondElut@

8.2.11 SAX固相萃取柱500mg/10mL Varian BondElut@

8.2.12 SCX固相萃取柱100mg/10mL Varian BondElut@

8.2.13 微孔滤膜孔径0.45μm

9检验步骤

9.1试料的制备

9.1.1取匀浆后的供试样品,作为供试试料。

9.1.2取匀浆后的空白样品,作为空白试料。

9.1.3取匀浆后的空白样品(2±0.05)g,添加适量浓度的标准工作液(肌肉:10.0μg/mL标准工作液0.2mL;脂肪、肝脏:10.0μg/mL标准工作液0.4mL;肾脏:100μg/mL标准工作液0.12mL),作为空白添加试料。

9.2提取与衍生

9.2.1取试料(2±0.05)g,加提取液30.0mL,于振荡器中中速振荡5min。取提取液15.0mL(相当于1.0g组织),移至50mL离心管中。在50℃水浴中,转速为20~30r/min振摇提取15min。

9.2.2每个离心管中加碘乙酰胺溶液3mL,混匀后,室温下放置衍生30min。于4℃下

10 000r/min离心20min。上清夜转入另一离心管中,备用。

9.3净化

9.3.1 C18固相萃取柱净化

依次用甲醇4mL和磷酸盐缓冲液5mL对C18固相萃取柱进行预洗。在柱中加上清液,

过柱。依次用磷酸盐缓冲液5mL和0.01M氢氧化钠溶液3mL洗柱,挤干。加C18柱洗脱液3mL,收集洗脱液,用水15mL稀释至总体积为18mL,混匀。

9.3.2 SAx固相萃取柱净化

依次用甲醇2mL、SAX柱预洗液2mL和水2mL对SAX固相萃取柱进行预洗。在柱中加C18固相萃取柱的稀释提取液,过柱,用水1mL洗,挤干。加SAx柱洗脱液3mL,收集洗脱液。加水10mL,使总体积为13mL,混匀。

(注:脂肪组织稀释提取液过SAX柱后,用水1mL洗,挤干。加SAX柱洗脱液2.0mI.,收集洗脱液。充分混匀,将洗脱液移至进样瓶中,用HPLc法进行分析)

9.3.3 SCX固相萃取柱净化

依次用甲醇1mL、SCX柱预洗液2mL和水2mL对SCX柱进行预洗。在柱中加入SAX固相萃取柱的稀释提取液,过柱,用水lmL冲洗。

9.3.4将SCX固相萃取柱挤干或真空中抽干,用SCX柱洗脱液2.0mL洗脱,挤干,收集洗脱液,充分混匀后作为试样溶液,供高效液相色谱法测定。

9.4测定

9.4.1 色谱条件

9.4.1.1 色谱柱:C18柱,250mm×4.6mm(i.d.),粒径5μm,或相当者。

9.4.1.2 检测波长:266nm。

9.4.13 柱温:30%:。

9.4.1.4 流速:1.0mL/min。

9.4.1.5 进样量:40μL。

9.4.1.6 流动相A:(0.1%TFA水溶液);流动相B:(0.1%TFA乙腈溶液)。

9.4.1.7 梯度程序:流动相A、流动相B梯度增加。完全梯度洗脱和再平衡的时间为lh。流速为1.0mL/min。

注:步骤O:为不同运行间平衡15min。

步骤1:为线性梯度至25%乙腈,时间为25min。

步骤2:为立即转换为50%乙腈,时间为5min。

9.5 测定法

9.5.1将系列标准溶液按样品提取步骤处理后,从低浓度到高浓度依次测定,每一浓度进样3针,按其所得峰面积的平均值与对应的对照溶液浓度作标准曲线,并计算回归方程及相关系数。

9.5.2取适量试样溶液和相应的标准工作溶液(肌肉:0.5μg/mL;脂肪、肝脏:1μg/mL;肾脏:3μg/mL),作单点或多点校正,以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中头孢噻呋的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下,头孢噻呋的保留时间在20min左右,标准溶液和试样溶液的液相色谱图见附录中图1、图2。

9.5.3空白试验

除不加试料外,采用完全相同的测定步骤进行平行操作。

9.6记录与计算

9.6.1 记录项目

9.6.1.1逐项填写中国兽医药品监察所“检验记录”首页。

9.6.1.2对照品名称、来源、批号、含量。

9.6.1.3储备液、工作液及对照溶液制备及制备日期。

9.6.1.4试料制备、提取、净化、测定(包括测定过程中涉及的计量仪器编号)。

9.6.1.5原始数据(包括仪器测定图谱和打印的数据)。

9.6.1.6计算公式及计算过程(软件计算除外)。

9.6.2结果计算和表述

按下式计算试料中头孢噻呋的残留量(μg/kg):

式中:

X——试样中头孢噻呋的残留量(μg/kg);

A——试样溶液中头孢噻呋的峰面积;

AS——对照溶液中头孢噻呋的峰面积;

CS——对照溶液中头孢噻呋的浓度(ng/mL);

V——SCX柱洗脱液的体积(mL)。

m——试样的质量(g);

(注:计算结果需扣除空白值,测定结果用两次平行测定的算术平均值表示,结果保留3位有效数字)

9.7结果判定

9.7.1 线性范围

在0.06~10.0μg /kg范围内考察线性,计算回归方程,相关系数≥0.998

9.7.2准确度

本方法在100~6000μg/mL添加浓度的回收率为80%~110%。

9.7.3精密度

本方法的批内相对标准偏差≤15%,批间相对标准偏差≤15%。

9.7.4判定

当方法学考察结果符合上述规定时,供试组织中头孢噻呋的残留量X<定量限时,判定为未检出;方法定量限≤X<最高残留限量时,判定为符合规定;X≥最高残留限量时,判定为不符合规定。

10 附加说明

10.1 头孢噻呋在动物组织中的最高残留限量:

参考资料:兽药残留检测标准操作规程


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