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鸡蛋和鸡肉中尼卡巴嗪残留检测方法——高效液相色谱一串联质谱法
【来源/作者】周世华 【更新日期】2017-01-09

1、安全要求

实验操作时穿工作服、戴口罩和手套;提取和净化操作都应在通风橱中进行,避免溶剂气体吸人和皮肤接触;废弃的化学试剂收集到专用容器中集中处理。

2、急救措施

皮肤接触到有机溶剂或酸、碱溶液后用清水清洗,有机溶剂或酸、碱溶液溅入眼中用清水灌洗。

3、适用范围

该标准操作规程适用于鸡蛋和鸡肉中尼卡巴嗪残留标示物DNC残留量的确证检测。

4、职责

进行该项检验的检验员必须按该标准操作规程进行检验,质量监督员负责监督该标准操作规程的正确执行。

5、原理

试样中的尼卡巴嗪残留标示物4,4-二硝基苯缩脲(DNC)用乙腈提取后,用正己烷脱脂,再用75%甲醇水溶液进行液萃取,吹干浓缩后用高效液相色谱一串联质谱法测定,同位素内标法定量。

6、方法灵敏度

尼卡巴嗪在鸡蛋和鸡肉中的检出限均为O.5μg/kg,定量限均为1μg/kg。

7、注意事项

用75%甲醇水溶液饱和的正己烷去除脂肪步骤要尽量把中间乳化层弃去。

8、材料、仪器、试剂的准备及基本要求

除特别注明外,以下所用试剂均为分析纯;水为符合GB/T 6682规定的一级水。

8.1 对照品、试剂和药物储备液、工作液准备。

8.1.1 DNC对照品 纯度大于98.0%。

8.1.2 DNC-D8对照品 纯度大于98.0%。

8.1.3 无水硫酸钠

8.1.4 乙腈 色谱纯

8.1.5 甲醇 色谱纯

8.1.6 正己烷

8.1.7 0.1mol/L乙酸铵溶液的配制 称取1.93g乙酸铵,用250mL水溶解,摇匀即得。

8.1.8 75%甲醇水溶液的配制 量取75mL甲醇,再加入25mL水,摇匀即得。

8.1.9 DNC标准储备液的配制(1mg/mL) 称取约10.0mg DNC对照品,精密称定,置于10mL量瓶内,用DMF溶解并稀释至刻度,摇匀即得。4℃冰箱中保存,有效期为1个月。

8.1.10 DNC-D8内标储备液的配制(1mg/mL) 称取约10.0mg DNC-D8对照品,置于10mL量瓶内,用DMF溶解并稀释至刻度,摇匀即得。4℃冰箱中保存,有效期为1个月。

8.1.11 DNC标准工作液的配制(100ng/mL) 准确量取标准储备液0.1mL,置于10mL量瓶内,用DMF稀释至刻度,摇匀即得10μg/mL的标准溶液;从中准确量取0.1mL,置于10mL量瓶内,用DMF稀释至刻度,摇匀即得100ng/mL的标准溶液;从中准确量取2.0mL,置于10mL量瓶内,用DMF稀释至刻度,摇匀即得20ng/mL的标准工作液。4℃冰箱中保存,有效期为1个月。

8.1.12 DNC-D8内标工作液的配制(100ng/mL) 准确量取内标储备液0.1mL,置于10mL量瓶内,用DMF稀释至刻度,摇匀即得10μg /mL的标准溶液;从中准确量取0.1mL,置于10mL量瓶内,用DMF稀释至刻度,摇匀即得100ng/mL的内标溶液;从中准确量取2.0mL,置于lOmL量瓶内,用DMF稀释至刻度,摇匀即得20ng/mL的内标工作液。40C冰箱中保存,有效期为1个月。

8.2 仪器和设备

8.2.1 高效液相色谱一串联质谱仪(配电喷雾离子源)

8.2.2 天平 感量0.01g

8.2.3 分析天平 感量0.00001g

8.2.4 涡旋混合器

8.2.5 离心机

8.2.6 氮吹仪

8.2.7 恒温水浴加热器

8.2.8 离心管 50mL

8.2.9 微孔滤头0.45μm

9、 检验步骤

9.1 试料的制备

9.1.1 取匀质的供试样品,作为供试试料。

9.1.2 取匀质的空白样品(2±0.02)g,作为空白试料。

9.1.3 取匀质的空白样品(2±0.02)g,鸡蛋样品、鸡肉样品中添加20ng/mL标准工作液0.2mL,作为空白添加试料。

9.2 提取

9.2.1 称取试料各(2±0.02)g,置于50mL离心管内,加20ng/mL内标工作液0.2mL,再加无水硫酸钠2g,再加人乙腈8mL,涡旋0.5min,然后超声提取10min。

9.2.2 5000r/min离心10min,取上清液于40℃下氮气吹干。

9.3 净化

9.3.1 加入75%甲醇水溶液饱和的正己烷1mL,涡旋10s,再加入75%甲醇水溶液1.0mL,充分涡旋混合,然后置于40℃水浴中静置5min。

9.3.2 取出后2000r/min离心5min,取下层清液适量,过滤膜后供高效液相色谱一串联质谱仪测定。

9.4 测定条件

9.4.1 色谱条件

9.4.1.1 色谱柱:XBridge C18150mm×2.1mm(i.d.),粒径5μm,或相当者。

9.4.1.2 流动相:甲醇+O.1mol/L乙酸铵溶液(75+25,v/v)。

9.4.1.3 流速:0.2Ml/min。

9.4.1.4 柱温:30℃。

9.4.1.5 进样量:20μL。

9.4.2 质谱条件

9.4.2.1 离子源参考参数,见表1。

9.4.2.2质量分析器参考参数见表2。

9.4.2.3 光电倍增器电压:650V。

9.4.2.4 定性、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量见表3。

9.5 检测数据的质量控制

9.5.1 线性考察

分别精密量取适量的DNC标准工作液,制得浓度为2ng/mL、20 ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL(含内标为100ng/mL)的系列对照溶液,从低浓度到高浓度测定,每一浓度进样3针,按所得峰面积与内标峰面积比值与相应的对照溶液浓度作标准曲线,并计算回归方程及相关系数。

9.5.2 空白实验和添加试验

空白试料、阳性添加试料的提取和净化采用与试料相同的方法操作。对照溶液和试样溶液中各特征离子质量色谱图分别见附录中图1、图2和图3。

9.5.3 序列表的编制顺序

试剂空白进1针;

样品空白进2针;

对照溶液进3针,其RSD<10%;

样品1一l、1—2各进1针;

……………

样品4—1、4—2各进1针;

阳性添加各进1针;

对照溶液进2针;

……………

(注:顺序的任何调整都应有充分理由证明其合理性)

9.5.4 定性需同时满足下列条件:

9.5.4.1 试剂空白和样品空白不能出现与阳性对照相同的离子峰。

9.5.4.2 所有离子色谱峰的信噪比(S/N)都在3∶1以上,信噪比以峰对峰(PtP)计算。

9.5.4.3 试样色谱峰的保留时间,应与校正溶液的保留时间一致,容许偏差为±2.5%。

9.5.4.4 试样溶液中的离子丰度比应与校正溶液的一致,容许偏差符合表4的要求。

9.5.5定量方法

采用单点校准或标准曲线校准,按内标法以峰面积比计算,即得。采用标准曲线校准时试样溶液及对照溶液中DNC及内标的峰面积比应在仪器检测的线性范围之内。

9.6 记录与计算

9.6.1 记录项目

9.6.1.1 逐项填写中国兽医药品监察所“检验记录”首页。

9.6.1.2 对照品名称、来源、批号、含量。

9.6.1.3 储备液、工作液及对照溶液制备及制备日期。

9.6.1.4 试料制备、提取、净化、测定(包括测定过程中涉及的计量仪器编号)。

9.6.1.5 原始数据(包括仪器测定图谱和打印的数据)。

9.6.1.6 计算公式及计算过程(软件计算除外)。

9.6.2 计算

式中:

As——对照溶液中相应DNC的峰面积;

A,is——对照溶液中相应DNC—D8的峰面积;

Cs——对照溶液中相应DNC的浓度(ng/mL);

Cis——对照溶液中相应DNC—D8的浓度(ng/mL);

C——试样溶液中相应DNC的浓度(ng/mL);

Cis——试样溶液中相应DNC-D8的浓度(ng/mL);

A——试样溶液中相应DNC的峰面积;

Ais—一试样溶液中相应DNc-D。的峰面积;

X——试料中相应DNC的残留量(ng/kg);

V——溶解残余物所用试样溶液体积(mL);

m——试样的质量(g)。

(注:计算结果需扣除空白值,测定结果用平行测定的算术平均值表示,保留3位有效数字)

9.6.3结果判定

9.6.3.1 线性范围 DNC在2~500ng/mL范围内考察线性。计算回归方程,其相关系数R2≥0.990。

9.6.3.2 准确度 本方法对于鸡蛋样品在2~10ng/g添加浓度的回收率为80%~120%;对于鸡肉样品在2~300ng/g添加浓度的回收率为80%~120%。

9.6.3.3 精密度 本方法的批内相对标准偏差≤20cA,,批间相对标准偏差≤20%。

10、附加说明

10.1 本标准操作规程依据本实验室验证资料制定。

10.2 尼卡巴嗪的最高残留限量:

参考资料:兽药残留检测标准操作规程


【关键词】尼卡巴嗪,液相色谱,串联质谱法,奥科官网,北京世纪奥科 

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