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部分土壤酶活性的测定方法(二)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-02-24

4、操作步骤

称取相当于5g干重的新鲜土样(<2 mm)放置于150mL具塞三角瓶中,加入5mL尿素溶液(试剂1),混匀、塞上瓶塞。在370C下培养5h。然后加入50 mL的KCI-乙酸苯汞溶液,盖上瓶塞后在振荡机上振荡1h,用抽滤器过滤。

用移液管吸取滤液1mL~2mL(最多含200μg尿素)放入50mL容量瓶中,并加入KCI-乙酸苯汞溶液10mL和显色剂30mL。轻摇容量瓶几秒钟后,将其放于沸水浴中30min。然后,立即在流动的自来水中(或放里与装有大量凉水的容器中)降温约15min。再用水定容至50mL。用分光光度计(或光电比色计)在500nm~550nm(吸收高峰为527nm)处(或加绿色滤光片)比色测定。

为了配制0μg、25μg、50μg、100μg、150μg和200μg尿素的标准溶液系列,要先将已配制的尿素标准溶液用KCl-乙酸苯汞溶液稀释10倍。分别吸取0mL、1mL、2mL、4mL、6mL和8mL该溶液至50mL容量瓶中,并用KCI-乙酸苯汞溶液稀释至50mL。然后,以上述方法进行显色和比色。

5、结果计算

式中: ω(N)——单位时间内尿素态氮的减少量,mg ·kg-1· h-1;

m1——侧试样品溶液中尿素含量,μg;

V1——浸提液总体积,mL;

V2——测定时吸取浸提液的体积,1或2 mL;

0.466——尿素含氮系数;

m2——土壤样品质量,5g;

t——培养时间,5h。

6、注意事项

采用此法估计脲酶的活性必须严格按照步骤进行。此外,NO2含量超过尿素含量5倍时,将干扰尿素的测定。

三、磷酸单酯酶活性的测定(对硝基苯磷酸盐法)

磷酸酶是土壤中广泛存在的一种水解酶,能够催化磷酸酯的水解反应,包括磷酸单酯酶、磷酸二酯酶、三磷酸单酯酶等。其中,磷酸单酯酶由于与有机磷的矿化及植物的磷素营养关系密切,因此是研究最多的磷酸酶。磷酸单酯酶又基于其反应的最适pH值,分为酸性(pH5~pH6)和碱性磷酸酶(pH8~pH10)。磷酸单酯酶能够催化β-甘油磷酸酯、苯磷酸酯、β-蔡磷酸酯、硝基苯磷酸酯等的水解。磷酸根的存在对磷酸单酯酶的活性有竞争抑制作用。此外,重金属和微量元素也抑制磷酸单酯酶的活性。

测定磷酸单酯酶活性的方法有很多,这些方法的区别主要体现在所用的底物不同,以及由此产生的测定水解产物的方法各异。目前常用的是用对硝基苯磷酸脂法测定磷酸单酯酶的活性,用双对硝基苯磷酸脂法测定磷酸二酯酶的活性。

1、方法原理

测定磷酸单酯酶是基于该酶能够水解对硝基苯磷酸盐,通过比色法测定反应后释放的对硝基苯酚的含量,来估计磷酸单酯醉的活性。酸性和碱性磷酸酶的活性可通过控制反应的pH值来分别测定。测定酸性磷酸酶活性时,溶液的pH为6.5,碱性磷酸酶的pH位为11。

2、仪器

50mL三角瓶;恒温培养箱或恒温水浴;光电比色计或分光光度计。

3、试剂

所用试剂均为分析纯。

(1)甲苯;

(2)通用缓冲液:称取12.1g三(羟甲基)氨基甲烷,11.6g丁烯二酸、14.0g柠檬酸和6.3g 硼于488mL氢氧化钠溶液〔c(NaOH)=1mol·L-1]中,然后用水稀释至1L,低温贮存备用;

(3)pH6.5缓冲溶液:取200mL通用缓冲溶液至500mL烧杯中,用盐酸溶液[c(HCI)=0.1mol·L-1调至pH6.5。然后,用水稀释至1L;

(4)pH11缓冲溶液:取200mL通用缓冲溶液至500mL烧杯中,用0.1mol·L-1氢氧化钠调至pH11。然后,用水稀释至1L;

(5)对硝基苯磷酸钠溶液〔(c(C6H4NO2Na2PO4)=0.05mol·L-1 )]:称取0.840g四水对硝基苯磷酸二钠两份分别溶于40mL pH6.5或Ph11的缓冲溶液,然后用同一缓冲溶液稀释至50mL,低温贮存备用;

(6) CaCl2溶液〔(c(CaC12)=0.5 mol·L-1)]:称取73.5g CaCl2·2H20于700 mL水中,溶解后稀释至1L;

(7) NaOH溶液〔(c(NaOH)=0.5mol·L-1)]:称取20g NaOH于700mL水中,溶解后稀释至1L;

(8)对硝基苯酚标准溶液:溶解1.0g对硝基苯酚(C6H5N03)于700 mL水中后,稀释至1L,低温保存。

4、操作步骤

将1.00g新鲜土样(<2 mm)放置于50mL三角瓶中,然后加入0.2 mL甲苯,4mL缓冲溶液(酸性磷酸酶,加pH6.5的缓冲液,碱性磷酸酶加pH11的缓冲溶液)和1mL对硝基苯磷酸二钠溶液。轻摇混匀并塞上瓶塞。在37℃下培养1h。然后加入1mL的CaCl2溶液和4mL NaOH溶液,轻摇几秒钟后,滤纸过滤。用分光光度计在400nm~420nm进行比色,测定溶液(黄色)的吸光值,或用光电比色计加蓝滤色片测定。

同时,配制工作曲线用的对硝基苯酚标准溶液。为此,先将已配制的标准溶液用水稀释100倍,再分别吸取稀释后的标准溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL和mL,于50 mL三角瓶中(分别含0mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg的对硝基苯酚),分别用水调至5mL,再加入1mL的CaC12溶液和4mLNaOH溶液,轻摇几秒钟。滤纸过滤,同样条件下比色。

参考资料:土壤农业化学分析方法

相关链接:

部分土壤酶活性的测定方法(一)


【关键词】土壤酶,酶活性,酶,国家标准物质网 

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