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氨基酸的测定(四)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-02-26

7、注意事项

为了减少残余染料对测定结果的影响。在染料结合反应中,当染料溶液的浓度和体积一定时,反应后残余染料的浓度决定于样品中碱性氨基酸的含量及样品称样量。因此要调节称样量,使染料结合反应后残余染料的浓度在1.2 mmol·L-1~1.8 mmol·L-1的范围内。而且为了获得可比较的结果,消除各种影响因素的干扰,加入丙酸醇(样品A,B)及未加入丙酸酐(样品C、D)的两份样品的残余染料浓度应彼此接近。因此,应称取两份不等量的样品。根据样品中碱性氨基酸含量的不同,加入丙酸醇的样品与未加入丙酸醇的样品的称样最比约为1.4:1。根据一些单位研究结果,推荐的称量列于表38-2中。

四、色氨酸的测定(乙醛酸法)

1、方法选择的依据

色氨酸也是重要的人体必需氨基酸之一。它在人与动物的新陈代谢中起着重要的作用,某些代谢产物对人的大脑功能及生长发育影响很大。已经发现,人类缺乏色氨酸会患癞皮病。然而色氨酸在绝大多数谷物中含量很低,且易被氧化和光解。被公认为“第二限制性氨基酸”。因此,不管从育种还是从营养的观点出发,测定色氨酸都是十分必要的。然而,色氨酸在酸性的介质中很不稳定,长期以来,人们一直在探索一种能适用于多种试样而又简单易行的测定方法。目前提出的方法很多,归结起来有三类:一是找出一种理想的水解方法,使色氨酸和其它的氨基酸一样且用离子交换色层进行测定;二是暴露具有反应活性的吲哚环,然后与某些试剂反应生成带色化合物,进行比色测定,三是利用色氨酸天然特有的近紫外吸收峰,对色氨酸进行分光光度或萤光测定。其中简单快速的乙醛酸法,具有一定的准确度和精密度,尤适用于高色氨酸育种筛选工作之用。

2、方法原理

谷物中蛋白质经木瓜蛋白酶作用水解出色氨酸,然后在浓硫酸存在的情况下,Fe 3+可将乙酸氧化为乙醛酸,色氨酸的吲哚基能与乙醛酸缩合,产生霍普金斯一库勒反应,生成红紫色的化合物,反应式如下:

溶液红紫色的强度与色氨酸的含量在一定范围内成正比,其最大的吸收峰在545nm,可进行比色测定。

3、主要仪器

培养箱;分光光度计。

4、试剂

(1)混合显色剂:(A)称取FeC13·6H2O0.27g,用水0.5 mL溶解后,再用冰乙酸溶解至1L;(B)硫酸溶液〔c( H2SO4)=30mol·L-1],使用前1h~2h将试剂(A)和(B)等体积混合,混合时防止发热,可在冰水中进行。

(2)乙酸钠缓冲溶液:称取乙酸钠16.406g,用水溶解稀释至2L,并用乙酸调节pH至7.0;

(3)木瓜蛋白酶溶液:称取木瓜蛋白酶0.4g溶于100mL乙酸钠缓冲溶液(试剂2)中,

(4)色氨酸标准溶液

贮备液:准确称取经105℃干燥2h的L-色氨酸0.020g,加少量温水溶解后,洗入200 mL棕色容量瓶中,用乙酸钠缓冲溶液(试剂2)稀释至刻度,浓度为100mg·L-1

系列标准液:分别吸取5mL、7.55mL、105mL、155mL、205mL贮备液于50 mL容量瓶中,用乙酸钠缓冲溶液稀释至刻度,此浓度为10mg·L-1、15mg·L-1、20mg·L-1、30mg·L-1、40 mg·L-1系列标准溶液。

5、操作步骤

称取风干磨碎过60目筛的脱脂谷物样品100mg于具塞试管中,加木瓜酶液5 mL,混匀后放入65℃培养箱16 h,另用木瓜酶液5 mL作空白,放置16 h,并每隔 30 min摇一次。16h小时后取出水解液,摇匀,冷却至室温,在3000 r·min--1离心10 min。吸上清液1 mL于试管中,加混合显色剂4 mL,摇匀,置65oC培养箱中显色15 min。取出冷却至室温,在最大吸收峰545 nm波长比色得吸收值(A)。

标准曲线绘制分别吸取系列色氨酸标准工作液1mL,于具塞试管中,加入混合显色剂4mL,在与样品相同条件下显色后比色,并绘制标准曲线。

6、结果计算

色氨酸含量(g·kg-1)=p×V÷m

式中:P——从标准曲线上查得比色液中色氨酸浓度,mg·L-1

V——为比色液休积,mL;

m——样品质量,g。

7、注意事项

冰乙酸中必须含有低量的乙醛和高含量的乙醛酸,如果质量不好,则不形成颜色,为此可在试剂(A)中加入的80g·L-1乙酸酐,可解决显色问题。

参考资料:土壤农业化学分析方法

相关链接:

部分土壤酶活性的测定方法(一)

部分土壤酶活性的测定方法(二) 

部分土壤酶活性的测定方法(三)


【关键词】基酸,农业植物,游离氯基酸,国家标准物质网 

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