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高效液相色谱法(HPLC)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-04-06

也称高压液相色谱法(High pressure liquid chromatography)或高速液相色谱法(Highspccd liquid Chromatography)。它是以液体作为流动相的一种色谱法。可用以分离检测极性强、分子量大及离子型有机物,尤其是对不易气化或受热易分解的农药残留检陇更能显示出优越性。近年来,采用高效固定相、高压泵、高灵敏度的检测器、柱前(后)衍生化技术和计算机联用等,大大提高了液相色谱的检测效率、灵敏度和操作自动化程度,现已成为检测环境中微量有机污染物的重要方法。此法也有以下不足:①溶剂(流动相)消耗量大,且很多溶剂对人体有害,②检测器种类较气相色谱少,且灵敏度也低,⑧液相色谱柱价格昂贵。

HPLC分液-液分配色谱、液-固的吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱等几大类。

1、色谱柱

色谱柱是液相色谱起分离作用的关键部件,由柱管和填充料组成。往管为内径均匀、管壁抛光的不锈钢管,常用的标准柱型为内径3.9mm或4.6mm,长15cm~25cm的不锈钢柱。目前,长度为3cm~5cm,填料3μm~5μm的短柱具有高效、省时,节约溶剂的优点,应用范围有增大的趋势。

(1)填充剂

填充剂有薄壳型微球(30μm~45μm),深孔大顾粒全多孔TJ (20μm~40μm〕和歉粒很少的短孔全多孔型((3μm~10μm)三种。应根据待测物的理化性质来选定所需使用不同的固定相。常用的吸附色谱所用的固定相有:硅胶、氧化铝、氧化镁、分子筛(极性)和活性炭(非极性)。用于分配色谱的固定相有:正十八烷(ODS)、异三十烷(SQ)、聚乙二醇(PEG),β,β'-氧二丙晴(ODPN),聚酞胺等键合固定相。用于离子交换色谱的固定相有离子交换剂,用于凝胶色谱的固定相有凝胶等。

在固定相确定后,为使待测物各组分分离,还需选用适当的流动相。

(2)流动相

流动相也称洗脱液或载液。它除了象气相色谱仪中载气那样携带样品中各组分移动外,更重要的是还起到溶解待测物并使其各组分分离的作用。流动相可分为极性和非极性二大类。当流动相极性比固定相极性大时,称反相液相色谱:反之,称正相色谱。

用作流动相的溶剂应具备以下条件:①具有稳定的化学性质,不能和固定相发生化学反应,也不能引起固定相表面活性基团的流失和基质的溶胀;②纯度高或易于纯化。③沸点不宜太低,④无毒或低毒,⑤溶剂性能应与所使用检测器相匹配(不得有干扰);⑥对样品各组分既要有良好的溶解性,又要有合适的极性,从而使各组分达到充分地分离;⑦粘度要低,否则流动受阻。

2、检测器

液相色谱的检测器能连续将随载液流出的各待测组分的量随时间变化悄况转化为电信号输人记录仪或电脑以进行定量、定性分析。现一般用于有机污染物检测分析的检测器主要是紫外吸收检测器,其次为萤光检测器。理想的检测器应具备如下优点:①灵敏度高、重复性好。②噪声响应低;③线性范围宽;④对溶剂、流动相流速或环境很度的变化不敏感,⑤稳定性好,操作方便。

(1)紫外吸收检测器〔UV)

UV是目前应用最为广泛的检定器,具有较高的灵敏度、检测限较低(最低检出浓度可达5×10-4mg·L-1)、线性范围宽((5×104mg·L-1、流动相和温度的变化对基线影响不大、稳定性好及不破坏待测物等优点。不过UV只可检测对紫外光有吸收的有机物。

UV可分为固定波长检测器和可变波长检测器两种。固定波长检测器通常使用低(254nm)和中压(280 nm)汞灯光源。波长为254 nm的检测器,因光派强度很大,噪音幅度很低,故灵敏度很高。可调式检测器波长范围为200 nm~400nm,常选用氮灯或旅灯为光源。还有的以钨灯为光源,可检测波长范围为400 nm~600nm。

(2)荧光检侧器(FD)

FD为一种灵敏度高、选择性强的检测器,虽不如紫外检测器应用那样广泛。但它具有比UV灵敏度高1个~2个数量级的优点,故也是常用的检测器。在紫外光照射下,具有对称共扼体系的分子(如多环芳烃类化合物)发射荧光,可用荧光检测器测定。一些含卤素、重金属、氧、硝基的化合物,易使荧光熄灭,用FD时应给予注意。

参考资料:土壤农业化学分析方法


【关键词】高压液相色谱法,色谱柱,检测器,国家标准物质网 

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