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维生素的测定(二)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-11-01

②标准曲线的绘制:采用内标法定量。把一定量的维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚及内标苯并[e]芘溶液混合均匀。选择合适灵敏度,使上述物质的各峰高约为满量程70%,为高浓度点。高浓度的1/2为低浓度点(其内标苯并[P]芘的浓度值不变),用此种浓度的混合标准进行色谱分析,结果见色谱图(图5—11)。维生素标准曲线绘制是以维生素峰面积与内标峰面积之比为纵坐标,维生素浓度为横坐标绘制,或计算回归方程。如有微处理机装置,则按仪器说明用两点内标法进行定量。

不能将δ-生育酚和γ-生育酚分开,所以γ-生育酚峰中包含有β-生育酚峰。

(3)高效液相色谱分析:色谱条件(参考条件)如下。

①预柱:ultrasphere ODS 10μm,4mm×4.5cm。

②分析柱:ultrasphere ODS 5μm,4.6mm×25cm。

③流动相:甲醇+水=98+2,混匀,临用前脱气。

④紫外检测器波长:300nm,量程0.02。

⑤进样量:20μL。

⑥流速:1.7mL/min。

(4)试样分析取试样浓缩液209L,待绘制出色谱图及色谱参数后,再进行定性和定量。

①定性:用标准物色谱峰的保留时间定性。

②定量:根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值,以此值在标准曲线上查到其含量,或用回归方程求出其含量。

5、计算

                        

式中:X——维生素的含量,mg/100g;

c——由标准曲线上查到某种维生素含量,μg/mL;

V——试样浓缩定容体积,mL;

m——试样质量,g。

计算结果表示到三位有效数字。

6、说明及注意事项

本方法为GB/T 5009.82—2003标准第一法。本方法检出限分别为:维生素A:0.8ng;

α-生育酚:91.8ng;γ-生育酚:36.6ng;δ-生育酚20.6ng。

(二)维生素D的测定——三氯化锑比色法(AOAC法)

1、原理

维生素D在三氯甲烷溶液中,与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物,颜色的深浅与维生素D的浓度成正比,在500nm波长下测定其吸光值。

2、仪器

①可见/紫外分光光度计。

②分离柱。

3、试剂

①三氯化锑(250g/L)-三氯甲烷溶液:将25g干燥的三氯化锑迅速投入装有100mL三氯甲烷的棕色试剂瓶中,振摇,使之溶解,再加入无水硫酸钠10g。用时吸取上层清液。

②三氯化锑-三氯甲烷-乙酰氯溶液:在上述试剂①中加入为其体积3%的乙酰氯,摇匀。

③无水乙醚:不含过氧化物,检查方法与处理方法同维生素A和维生素E测定。

④无水乙醇:不含醛类物质,检查方法与处理方法同维生素A和维生素E测定。

⑤石油醚(沸程30~60℃):重蒸。

⑥维生素D标准溶液:称取O.25g维生素D,用三氯甲烷稀释至100mL,此液浓度为2.5mg/mL。临用时以三氯甲烷配制成0.025~2.5μg/mL的标准使用液。

⑦乙二醇(PEG)600。

⑧白色硅藻土:Celite545(柱色谱载体)。

⑨氨水。

⑩无水硫酸钠。

⑪氢氧化钾溶液(O.5mol/L)。

⑫中性氧化铝:色谱用,100~200目。在550℃灰化炉中活化5.5h,降温至3000C左右,取出装瓶。冷却后,每100g氧化铝加入4mL水,用力振摇,使无块状,瓶口封紧储存于干燥器内,16h后使用。

4、操作方法

(1)试样处理:皂化与提取同维生素A和维生素E的方法,如果试样中有维生素A共存,可用以下方法进行分离纯化。

①分离柱的制备:取一支内径为2.2cm,具有活塞和砂芯板的玻璃色谱柱。第一层:加入1~2g无水硫酸钠,铺平整。第二层:称取15g Celite545置于250mL碘价瓶中,加入80mL石油醚,振摇2min,再加入10mL聚乙二醇(PEG)600,剧烈振摇10min,使其黏合均匀,然后倾入色谱柱内。第三层:加5g中性氧化铝。第四层:加入2~4g无水硫酸钠。轻轻转动色谱柱,使第二层的高度保持在12cm左右。

②纯化:先用30~50mL石油醚淋洗分离柱,然后将试样提取液倒入柱内,再用石油醚继续淋洗。弃去最初收集的lOmL滤液,再用200mL容量瓶收集淋洗液至刻度。淋洗速度保持2~3mL/min。将淋洗液移入500mL分液漏斗中,每次加100~150mL水,洗涤3次(去除残留的聚乙二醇600,以免与三氯化锑作用形成浑浊物,影响比色),将上述石油醚层通过无水硫酸钠脱水后,置于浓缩器中减压浓缩至干或在水浴上用水泵减压抽干,立即加入5mL三氯甲烷溶解备用。

(2)测定

①标准曲线的绘制:准确吸取维生素D标准使用液(浓度视试样中维生素D含量高低而定)0mL、1.0mL、2.OmL、3.OmL、4.OmL、5.OmL于10mL容量瓶内,用三氯甲烷定容。取上述标准比色液各lmL于1cm比色皿中,立即加入三氯化锑-三氯甲烷-乙酰氯溶液3mL,在500nm波长下,于2min内测定吸光度。绘制标准曲线。

参考资料:食品检测技术


【关键词】维生素,食品检测,成分,检测,国家标准物质网 

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