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1.1仪器和试剂

高效液相色谱仪(Agilent 1100)；

色谱柱Agilent Zorbax SB- C18(5um, 250mm×4.6mm)；

UV检测器；

超声波清洗器；

数控KQ- 100DE型；

0.45um有机溶剂过滤膜；

索氏抽提装置；

常压蒸馏装置；

粉碎机；

甲醇(HPLC级)；

四氢呋喃(A.R)；

乙醇(A.R)；

丙酮( A.R)；

水(HPLC级)；

辣椒素标样(纯度95%),二氢辣椒素标样(纯度90%)。辣椒及辣椒制品。

1.2 色谱条件

流动相为V(甲醇): V(水)=80: 20,流速0.8mL/min,柱温30.0℃, UV检测器波长280nm,进样量10微升。

1.3溶液制备

1.3.1 标准溶液称取25mg辣椒素(纯度95%)和25mg二氢辣椒素(纯度90%),放入经甲醇洗涤过的烧杯中，加入少量甲醇溶解，然后将溶液转入25mL容量瓶中，用甲醇定容,作为标准贮备液。再分别量取辣椒素、二氢辣椒素标准贮备液各1mL置入10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为标准溶液。

1.3.2样品溶液

(1)辣椒油(酱):将辣椒油(酱)均质,准确称取2.5g样品(如果辣椒素含量少,取样量可增加）于100mL烧杯中，加入甲醇+四氢呋喃(50+50)混合溶液25mL,用塑料薄膜封口后使用超声波清洗器提取30min。用滤纸过滤,收集滤液,然后将滤渣连同滤纸重新用甲醇+四氢呋喃(50+50)混合溶液25mL,使用超声波清洗器提取10min,重复两次。将三次过滤收集的滤液合并后浓缩，然后用甲醇+四氢呋喃(50+50) 混合溶液定容至50mL,经0.45um滤膜过滤后进行色谱分析。

(2）干辣椒或固态食品:将样品用电动粉碎机粉碎,过40目筛,称取2.5g样品,后处理方法同(1)。

(3)新鲜辣椒或含量较高的辣椒制品:用组织捣碎机捣碎样品,后称取10.0g样品,适度烘干,并去掉大部分水，然后处理方法同(1)。

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2.1样品预处理条件的选择

2.1.1提取溶剂的选择根据文献(其提取溶剂为四氢呋喃)及其它参考资料,分别选用甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、甲醇+四氢呋喃(50+50)混合溶液、甲醇+丙酮(50+50)混合溶液作提取溶剂,结果是甲醇+四氢呋喃(50-50)混合溶液作提取溶剂时提取效果最好(图1)。

2.1.2提取方法的选择，样品处理是用四氢呋喃溶液作提取溶剂，用索氏抽提仪连续抽提8h,将提取液用甲醇+四氢呋喃(50+50)混合溶液定容后进行分析。由于此预处理耗时太长，因此我们采用更简单省时的方法进行样品预处理。即采用索氏抽提法和超声波提取法,用甲醇+四氢呋喃(50+50)混合溶液作提取溶剂提取辣椒素,测定结果见表1。

2.1.3 辣椒素提取条件的正交试验阿设计一个以A为提取温度、B为提取时超声波功率、C为提取时间的三因素三水平L₉(3³)正交试验,结果见表2所示。

由正交试验可知，用甲醇+四氢呋喃(50+50)混合溶液为提取溶剂，提取辣椒素的最佳条件为A，B，C,即提取温度60℃、提取时间50min、提取功率为100%的条件下提取效果最好。从试验结果还可知，A因素极差最大,说明提取温度是影响试验的最主要因素,其次提取时间对提取效果也有较大影响,时间太短,提取不够彻底，时间太长，结果反而降低,说明长时间超超波可能对辣椒素造成破坏。

2.1.4提取时间的确定为了更彻底的提取辣椒素,我们考虑重复提取三次。方法是称取适量样品于100mL烧杯中,取甲醇+四氢呋喃(50+50)混合溶液25mL,采用不同的时间组合重复提取3次。将3次过滤收集的滤液合并后浓缩，然后用甲醇+四氢呋喃(50+50)混合溶液定容至50mL,经0.45um滤膜过滤后进行色谱分析。根据试验结果发现总提取时间控制在50min内，时间组合为30+10+10min时提取效果最好。

另外，我们还分别将提取3次与提取1次和2次的结果进行对比，并且用于提取的溶剂总体积数均为75mL。结果发现,重复提取3次的结果明显高出提取1次和2次的结果(表4),因此我们决定重复提取3次,总提取时间控制在50min内,时间组合为30+ 10+10min。

2.1.5 新鲜辣椒样品的处理 对不同类型样品处理后进行分析,结果发现直接将新鲜辣椒打浆后取用,不管是用索氏抽提法(8h)或超声波提取法,提取效果均不理想(见表1),因此考虑将新鲜辣椒适度烘干,去掉大部分水分后,再进行提取。结果发现新鲜辣椒或含水量高的样晶需首先经脱水才有利于辣椒素的提取。

2.2流动相和仪器条件的选择

采用甲醇+纯水作流动相,比例在(70+30)~(85+15)范围,流速在0.6~1.2mL/min之间进行测定，结果发现比例在(80:20)，流速在0.8mL/min出峰时间合适,峰形好,分离效果最为理想。综合考虑,确定测定的色谱条件是流动相V(甲醇):V(水)=80: 20,流速0.8mL/min，柱温30.0℃,UV检测器的波长为280nm,进样量10uL。此条件下的标准及样品色谱图见图2。

2.3线性回归方程、线性范围及最低检出限

在1.0~100.0μg/mL依度范围内，配制一系列辣椒素标准溶液和二氢辣椒素标准溶液,按上述色谱)分析条件进行分析,峰面积(Y)与辣椒素或二氢辣椒素进样量(X, μg)呈良好线性关系，求得回归方程分别是:

辣椒素: Y=95.51X+6.416, r=0.9996。在信噪比等于2时,检出限为0.74ng。

二氢辣椒素: Y=74.83X+4.532, r=0.9992。在信噪比等于2时,检出限0.91ng。

2.4精密度试验

分别取辣椒素、二氢辣椒素标准液10μL,重复进样(n=5),统计峰面积，计算相对标准偏差,结果

辣椒素: RSD=1.59%(n=5),二氢辣椒素: RSD=1.61%(n=5),表明在该色谱条件下精密度良好。

2.5重复性试验

取同一批辣椒样品5份，按样品测定方法依次浊定,结果辣椒素:RSD=2.73%(n=5),二氢辣椒素:RSD=2.29%(n=5),表明此方法重复性好。

2.6加样回收试验

为考察整个方法的可靠性,对10份样品分别采用高、中、低3个浓度水平进行辣椒素的加样回收试验，计算回收率。结果平均回收率分别为:辣椒素92.9%,二氢辣椒素92.4%。

2.7结果计算

2.7.1

辣椒素总量计算辣椒素总量以辣椒素与二氢辣椒素之和除90%计算。因为本方法只测定了辣椒素总量中的主要化学成分辣椒素和二氢辣椒素，而对其它二者的同系物未进行测定。辣椒素和二氢辣椒素二者约占辣椒素总量的90%，也提供了约90%的辣感和热感。计算见式(1)、(2)、(3)。

式中:X:试样中辣椒素的含量mg/g；

C:由标准曲线上查到辣椒素或二氢辣椒素的含量(ug/mL)；

V：样品定容体积(mL)；

M:样品质量(g)；

95%:二氢辣椒素标样纯度；

式中:X:试样中二氢辣椒素的含量mg/g；

C:由标准曲线上查到辣椒素或二氢辣椒素的含量( g/mL)；

V:样品定容体积(mL)；

M: 样品质量(g)；

90%:二氢辣椒素标样纯度。

2.7.2辣度计算用 Scoville指数法。