北方伟业计量集团有限公司
提取RNA或重复使用样品时,可能会引入少量的RNase污染。正确的存储可以减少RNase污染和随之而来的样品降解。有几个可供选择的用于存储纯化RNA的方法。
●用水性缓冲液溶解沉淀并存储于-80℃。常用缓冲液包括TE ( 10mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA, pH 7.0),含SDS (0.1%~0.5%)的TE (pH7.6),含有0.1mmol/LEDTA(pH7.5)的DEPC处理水,或商品化的RNA储存液(如RNA储存液,Ambion)。RNA在-80℃下可稳定保存1年。EDTA是一种镁和其他金属离子的螯合剂,可以避免这些金属离子对RNA的非特异性降解;使用EDTA溶液要保证无RNase。SDS是一种核酸酶抑制剂:在用RNA作为模板之前,如用于引物延伸反应、反转录或体外翻译时,应用氯仿抽提和标准乙醇沉淀法去除SDS。
●用盐/乙醇混悬液( salt/ethanol slurry) 在-80℃下储存RNA。将RNA按标准沉淀步骤沉淀,即盐(1/10体积的3mol/L乙酸钠)和乙醇(2倍体积的100%乙醇)在-80°C下存储该混合物,不需要通过离心沉淀RNA。低pH、高乙醇含量及低温的结合将稳定RNA并抑制酶活性,这是长期储存RNA的首选方法。当需要时,可以使用自动移液装置回收RNA样品。然而,由于沉淀的RNA是块状并有黏性,黏在一次性吸头表面上会造成部分损失,导致RNA的回收量损失。可以离心得到RNA沉淀,并溶解在水溶性缓冲液,然后再吸取。
●用去离子甲酰胺溶解沉淀,并储存于-20°C。在这种条件下,RNA至少可以稳定保存1年( Chomczynski 1992)。 甲酰胺提供了稳定的化学环境,可保护RNA不被RNA酶降解。甲酰胺可以很快溶解纯的无盐RNA,浓度可大于4mg/mL,这样浓度的RNA样品可以直接进行凝胶电泳、RT-PCR或RNase保护分析,既省时又避免了潜在因素的降解。如果需要,用4倍体积的乙醇进行沉淀,如Chomczynski (1992)所述,或用0.2mol/L NaCl 4倍稀释甲酰胺,然后加入常规2倍体积的乙醇(Nadin-Davis and Mezl 1982)可以回收溶于甲酰胺溶液中RNA.
当从存储状态回收RNA样品时,最好是在冰上解冻样品,以避免被RNase降解。此外建议按使用量分装RNA,这样可避免反复冻融对RNA的损伤,并可防止RNase污染。
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