1、适用范围:

适用于牛奶中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。

2、参考标准

《GBT 22990-2008 牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-紫外检测法》

3、原理:

试 样 中 四 环 素 类 抗 生 素 残 留 用 0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液 (pH=4.0±0.05)：甲醇 (9:1) 提取，经涡旋和离心后，取上层清液，用月旭公司 BRP 固相萃取柱净化，然后用 HPLC-UV 测定，外标法进行定量。

4、试剂:

试剂1：磷酸氢二钠 0.2mol/L：称取十二水合磷酸氢二钠 71.63g，加水溶解，稀释到 1000mL。

试剂2：柠檬酸 0.1mol/L：称取柠檬酸单水合物 21.04g，加水溶解，稀释到 1000mL。

试剂3：移取 625mL 试剂1 与 1000mL 试剂2，混匀。

试剂4：0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine：称取 60.5g 乙二胺四乙酸(EDTA)二钠盐，用试剂3 溶解并混匀。用 0.1mol/L 的 HCl 或 NaOH，调节 pH 至 4.0±0.05，4℃ 保存。

提取液： Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液：甲醇=(9:1)。

5、提取步骤:

称取 5g 牛奶样品，加入 20mL 提取液，涡旋混合 1min，常温超声 10min，4000r/min 离心 10min，将上清液转移到 50mL 的容量瓶中，再分别用 15mL、10mL 提取液重复上述提取操作，合并上清液，并用提取液定容到 50mL，转移到离心管中，待净化。

6、SPE净化步骤:

SPE柱：月旭 Welchrom® BRP，

规格：200mg/6mL。

a) 活化：5mL 甲醇，5mL 水，弃去。

b) 上样：移取待净化液 5mL，弃去。

c) 淋洗：用 5mL 水淋洗小柱，弃去淋洗液，并抽干小柱。

d) 洗脱：用 2mL 甲醇，稍用负压将小柱湿润，再用 20mL 乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，抽干小柱。

e) 浓缩：将收集的洗脱液在 40℃ 加热条件下氮吹吹干，然后用甲醇复溶并定容到 1mL，并过 0.22µm PTFE 滤膜，上高效液相色谱仪检测。

7、注意事项:

(1) 标准是用 0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 进行提取的，但实验效果不佳，后改成 Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液：甲醇=(9:1)。

(2) 在过 SPE 小柱的过程中，“活化”和“上样”这两个步骤要注意不要使得小柱干涸，这样会影响小柱的回收率。而在“淋洗”步骤一定要抽干，因为乙酸乙酯和水是不互溶的。

(3) 加标过程：样品的加标量分别为 2mg/kg，1mg/kg，往 5g 牛奶加入 1mL 10µg/mL 和 0.5mL 10µg/mL 混标溶液，然后用提取液提取，最后用 Na2EDTA-Mallvaine 缓冲液定容至 50mL，准确移取 5mL 上固相萃取柱净化，最终定容到 1mL。

8、色谱条件:

色谱柱：

月旭Ultimate®Plus-C18（4.6 x 250 mm, 5 μm）

流动相：

A:0.01 mol/L 草酸溶液 B:乙腈：甲醇=18:5

洗脱梯度：

流速：1.0mL/min

进样量：10μL

柱温：30ºC

检测波长：350nm

9、色谱图或者加标回收率结果：

图1：牛奶样品色谱图

图2：对照品 0.5 μg/mL 色谱图

图3：牛奶样品加标 1mg/kg 图谱

图4：对照品 1 μg/mL 色谱图

图5：牛奶样品加标 2mg/kg 图谱

表1：加标回收率测定结果

由表1 可知，采用固相萃取结合高效液相色谱检测四种四环素类药物，加标量为 1.0mg/kg、2.0mg/kg，回收率为 82%~111%，能够满足检测要求。

由图1-5 可看出经 Welchrom® BRP 固相萃取柱净化，采用 Ultimate®Plus-C18 色谱柱检测能够使四种四环素药物得到良好的分离，且各种物质峰形良好，保留时间稳定。