刖目尿道下裂是因前尿道发育不全导致尿道开口畸形的一种疾病，是阴茎中最常见的先天性畸形，发生率约为〇3%到0.7%丨1'尿道下裂的确切机制尚不清楚，但环境内分泌干扰物(EEDs)被认为是导致该先天性疾病的潜在原因。DBP是EEDs典型代表，通常存在于聚氯乙烯塑料产品中，包括儿童玩具、药品、食品生产包装中。已经有大量实验证实DBP会影响生殖道发育，这其中包括尿道下裂。自噬在肿瘤发生发展、胚胎发育中起重要作用M。

有研究发现自噬与雄激素信号通路关系密切:雄激素剥夺能明显影响前列腺上皮细胞中自噬发生。DBP可诱导癌细胞产生自噬，但DBP诱导的自噬是否影响尿道下裂发生尚未得到评估孕期暴露于DBP可以成功建立子代尿道下裂模型但是其中具体的机制通路尚未明确揭示。我课题组本次研究发现DBP染毒组的子代大鼠GT组织存在自噬异常表达，并随后在PUECs中验证了雄激素缺乏可以诱导子代自噬水平升高。该研究结果可为DBP诱导的尿道下裂形成机制提供新的线索及干预方法。

1材料和方法

1.1动物和暴露设计

SD大鼠由上海实验动物中心提供，并给予常规饲料、无限制饮水。于适宜昼夜交替、温度、湿度下饲养。取未妊娠过的成年雌鼠20只，成年雄鼠40只，按雌：雄=1:2合笼，于次日下午4点寻找阴栓，找到阴栓当日记为妊娠期（gestationday,GD)第0天。将成功交配的雌性大鼠随机分配成对照组和DBP染毒组各10只，每天记录体重并分别饲养。将DBP(99.5%,SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)溶解在花生油中。孕鼠于GD14-18天给予DBP(750mg/kg/天）。对照组仅接受花生油。动物建模参见文献[|31。DBP染毒组52只雄性大鼠有22只存在尿道下裂。对照组42只雄性大鼠未发现尿道下裂。各选取10只用于样本采集和检测。大鼠于麻醉收集血液样品，并用二氧化碳使动物安乐死。获得的生殖器结节组织于液氮中冷冻保存以用于Western印迹，或储存在福尔马林中用于IHC染色。

1.2抗体和试剂

LC3抗体（#12741)K_CellSignalingTechnology(Danvers.MA’USA)。Beclin-1抗体(ab62472)和GAPDH(ab8245)购自Abeam(Cambridge，UK)。DHT(A8380)购自81§11»-Aldrich(Burlington，MA,US)。DBP溶于食用油（1:3)中并以胃饲法给药，剂量为750mg/kg/天。将DBP溶解于DMS0中至lOpmol/L以用于体外研究。

1.3细胞培养

PUECs来源于产后7天(PND7)上的胎鼠尿道组织。原代细胞建立过程由PriCellsBiopharmaceuticalCompany(中国武汉)辅助建立。PUECs培养在PriCcells上皮细胞培养基中，其中补充有10%胎牛血清(Gibco,FosterCity,CA)和1%青霉素/链霉素(HyClone)。细胞培养液为碳吸附胎牛血清与无酚红培养基去激素置配。DHT缺乏组为空白去激素培养液，对照组为空白去激素培养液中添加10nMDHT模拟正常雄激素环境。

1.4免疫组化

GT组织用福尔马林固定、石蜡包埋并切片（5pm)，再用苏木精和伊红(H&E)染色。经光学显微镜以鉴定尿道下裂。按照我们既往报道的方法进行IHC分析?。在连续乙醇稀释中脱蜡再水化后,于微波炉中修复抗原20分钟。然后进行洗涤，封闭和用抗体孵育。一抗是Beclin-1抗体（l:200,ab62472.Abeam),LC3抗体（1:200,#12741，CST)。

1.5蛋白质测定和Western印迹

使用具有l〇x蛋白酶抑制剂混合物(ThermoScientific)的RIPA提取试剂提取总蛋白质。通过BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。于聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE进行电泳。然后将凝胶的蛋白质转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上。随后于5%脱脂奶粉中封闭，并在Beclin-1抗体（1:1000，ab62472,Abeam),LC3(1:1000,#12741,CST)4°C下孵育。经TBST洗涤三次后，将膜与合适二抗一起温育1小时。使用SupersignalWestPico化学发光底物(Pierce)显现蛋白质印迹的结果。

1.6放射免疫分析

选用PND7的大鼠血清测定睾酮浓度。麻醉后自心脏收集血样。将血液中在4°C下以3000rpm离心15分钟以分离血清。按照我们既往报道的方法使用直接放射免疫测定试剂盒计算每只幼崽的睾酮浓度，重复=次，取算术平均浓度为最终睾酮浓度.

1.7统计分析

所有数据均以平均值±标准偏差(SD)表示。每个实验组的治疗条件相同。Mann-WhitneyU检验或独立样本t检验用于评估差异的显着性。使用SPSSv.20软件(IBM,Inc.)进行统计学分析。P值<〇.〇5被认为具有统计学意义。在PND7时，收集每只幼鼠的生殖器结节组织用于IHC及Western印迹。大鼠相关实验及体外实验均重复至少三次。