最近国抽实验中遇到胭脂红的检测，检测标准GB/T 9695.6-2018 中使用的流动相是甲醇和乙酸铵，使用的梯度洗脱。梯度洗脱给我们的检测带来方便的同时，也有很多隐患，如果使用的时候没有注意到，很可能给我们的分析带来困扰。

在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来些特殊问题，必须充分重视:

1、要注意溶剂的互溶性

不相混的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相，有些此溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当高比例有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的品体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。

2、梯度洗脱溶剂纯度要求更高

梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以排认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。

3、混合溶剂的黏度变化

混合溶剂的黏度常随组成而变化，因而在梯度选脱时常出现压力的变化，例如甲醇和水黏度都较小，当二者以相近比例混合时黏度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。（一般情况下，色谱柱和泵洗脱的耐压较高，主要是色谱柱前端堵头，一般PEEK头耐压在250bar左右，不锈钢堵头耐压在600bar左右）。

4、色谱柱再生处理

每次梯度洗脱后，需要对色谱柱进行再生处理。其恢复到初始状态。需让10~ 30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。在梯度中间段，使用强洗脱比例冲洗色谱柱，以冲出强保留组分。