肉制品中危害最大的细菌是肉毒梭状芽孢杆菌简称肉毒梭菌，该菌在厌氧环境中可产生肉毒毒素，肉毒毒素毒性比氰化钾强1万倍。由于肉毒梭菌产生的肉毒毒素的剧毒毒性，世界各国都允许肉毒梭菌抑制剂一亚硝酸盐作为食品添加剂在肉制品中限量使用。亚硝酸盐在肉制品中可以明显抑制肉毒梭状芽孢杆菌产生毒素。但是近几十年来，亚硝酸盐已成为食品安全争议的焦点。因为在一定条件下（比如高温），肉制品中残留的亚硝酸盐可以与游离氨基酸和胺类反应，生成痕量N-亚硝胺。动物及流行病学研究结果表明N-亚硝胺是强致癌物。

次磷酸钠可以抑制革兰氏阳性厌氧菌（包括肉毒梭菌），能够解决肉制品质量安全难题，并且国内次磷酸钠生产技术及水平不断提高，具备了生产食品级次磷酸钠的能力，目前已经到了系统的、全面的研究次磷酸钠替代亚硝酸盐的时机。次磷酸钠是一种较理想的工业用还原剂，主要用于化学镀、电镀、有机合成工业、食品加工和保鲜、工程塑料稳定剂。针对次磷酸钠的抑菌作用，国外研究人员已经开始研究次磷酸钠抑制肉毒梭菌的效果，试着作为亚硝酸盐抑菌剂的替代物，取得较好进展。Rhodehamel等人认为次磷酸钠口味上很温和，无刺激味，对肉制品的颜色和抗氧化性方面无副作用，另外，次磷酸钠是潜在的一种好的抑菌剂，并且在1990年被批准为安全物质（GRAS）。Woodetal和PeggandShahidi实验表明，次磷酸钠加入到肉浆中，对于肉毒菌素的抑制是有效的。

本研究用不同浓度的次磷酸钠（以下简称SHP）溶液对肉制品中常见的六种有害菌（生孢梭菌、产气荚膜梭、菌沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌）进行抑菌处理，通过对照组与实验组抑菌圈大小对比，判断SHP对六种菌的抑菌效果；并以有抑菌效果的菌种为研究对象，探索SHP的最小抑菌浓度；进一步摸索SHP抑制肉毒梭菌的最佳抑菌条件。

根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》分类原则，肉毒梭状芽孢杆菌属于实验室二级毒性菌，为高致病性病原微生物，对研究人员的人身安全有一定威胁，不适合实验室人员直接研究，由于生孢梭菌的危险性较小，并且其性质特征与肉毒梭菌极其相似，所以很多专家学者用生孢梭菌代替肉毒梭菌进行研究。因此，本论文所有试验均以肉毒梭菌的研究替代菌生孢梭菌来开展研究。

一、材料与方法

1、材料与试剂

次磷酸钠（SHP）：纯度≥99.8％，阿拉丁有限公司；生孢梭菌CICC（10385）冻干粉、产气荚膜梭菌CICC（22949）冻干粉、蜡样芽孢杆菌CMCC（B）63301冻干粉；

大肠杆菌0157（EPEC）、沙门氏菌（阿贡纳）、金黄色葡萄球菌ATCC（6538）、蒸馏水、液体石蜡、厌氧带；

强化梭菌培养基、PCA、LB肉汤培养基、强化梭菌琼脂；

氢氧化钙AR。

2、仪器与设备

生物安全柜、培养箱、冰箱、厌氧罐、分光光度计。

3、实验方法

（1）SHP梯度液的配制

抑菌效果实验SHP溶液配制：

取7个500mL容量瓶洗净灭菌，分别标号1～7。分别配制0mg/L、250mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L标准SHP溶液，摇匀。取7支干净已灭菌试管在无菌室中每支试管分别装入不同浓度的SHP溶液10mL，标号，橡胶塞灭菌塞紧，备用，切忌将溶液先装入试管然后加塞灭菌。最小抑菌浓度探索SHP溶液配制：

同上处理方法分别配制0mg/L、2000mg/L、2200mg/L、2400mg/L、2600mg/L、2800mg/L、3000mg/L标准SHP溶液。

（2）培养基的配制

强化梭菌培养基：称取本品38.0g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装若干试管中10mL，滴入适量液体石蜡封闭液面，加塞后121℃高压灭菌15min，备用。

LB肉汤培养基、PCA、强化梭菌琼脂：按说明称取相应本品，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装10个三角瓶中，121℃高压灭菌15min，备用。

（3）菌种活化与菌液配制

生孢梭菌、产气荚膜梭菌：生物安全柜中，用烧红冷却的接种环将菌种接入强化梭菌培养基试管中活化24h；按照GB测菌落总数，将原菌液适当稀释控制菌液浓度大概在105左右。

沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌：生物安全柜中用烧红冷却的接种环将菌种接入装有10mLLB的三角瓶中活化24h；按照GB测菌落总数（大概在2.37×108），将原菌液适当稀释控制菌液浓度大概在106左右。

（4）抑菌圈的测定

生孢梭菌、产气荚膜梭菌抑菌圈的测定：

灭菌玻璃平皿底部划分区域并编号1～7→倒平板每个平皿20mL→每个平板加100μL菌液涂布均匀一每个区域中央放上一个灭菌的牛津杯一每个牛津杯中加入200μL对应编号的SHP溶液一盖好盖子后放入厌氧罐中并放入厌氧带一封好厌氧罐盖子移入培养箱。做多组平行实验，36℃下培养24h，测量抑菌圈。

大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌抑菌圈的测定：灭菌玻璃平皿底部划分区域编号1～7→移液枪吸取1mL菌液分别加入到平皿中→加热融化PCA冷却至40～50℃倒平板→每个区域中央放上一个灭菌的牛津杯→每个牛津杯中用移液枪加入200μL对应编号的SHP溶液→盖好盖子移入培养箱。做多组平行实验，36℃下培养24h，测量抑菌圈。

（5）SHP对肉毒梭菌、产气荚膜梭菌最小抑菌浓度的测定

活化后原菌液摇匀→分装到7支试管中每支100μL一分别加入1～7号SHP溶液lOmL→摇匀滴入适量液体石蜡封闭，36℃下培养24h→取7支灭菌干净比色皿→分别加入1～7号菌液（摇匀）→600nm下测其吸光度确定MIC。

（6）生孢梭菌的最佳抑制条件测定

SHP对生孢梭菌抑制主要受温度、时间、pH因素的影响，选择L9（34）正交试验，设计方案如下。

取9个灭菌干净玻璃平皿分别编号1～9→倒平板每个平皿20mL→用移液枪每个平板加IOOμL菌液于培养基表面涂布均匀→每个平皿中放上三个灭菌的牛津杯→每个牛津杯中加入相应pH的SHP溶液200μL盖好盖子→放入厌氧罐中打开厌氧袋封好盖子→同一培养温度的实验组移入对应的培养箱→测量各实验组抑菌圈直径大小，拍照，记录，对比分析。对测量结果进行统计分析，找出最佳组合，从而确定SHP对生孢梭菌的最佳抑制条件。

（7）数据统计分析

每组实验重复3次测定，采用SPSSl9.0统计软件对数据进行统计及显著性分析，数据采用标准差表示。

二、结果与讨论

1、SHP对肉制品中的常见有害菌的抑菌效果

本研究选择肉制品中常见的危害菌，包括革兰氏阳性菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌；革兰氏阴性菌：沙门氏菌、大肠埃希氏菌，研究次磷酸钠对每种细菌是否有抑制效果。不同浓度的SHP对肉制品中的六种有害菌进行处理，采用牛津杯法，见图1，通过观察抑菌圈的生成情况来断定SHP对六种菌的抑菌效果，以及随SHP浓度变化的抑菌趋势。抑菌圈的大小体现了SHP抑菌效果的强弱，抑菌圈越大说明SHP的抑菌效果越好。

图1中，牛津杯的外直径为8.0mm。以下试验中处理的样品如果没有大于8.00mm的清晰的抑菌圈，视为没有抑菌作用。

声明：本文所用图片、文字来源《中国食品添加剂》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

相关链接：大肠埃希氏菌，蜡样芽孢杆菌，产气荚膜梭菌，革兰氏阳性菌