水稻(Ozyzasaliva)是亚洲最重要的主粮(张士陆等,2005),中国现有种植面积3.02xl08hm2,2016年产量达2.070751xlOHkgo随着粮食产量的持续提升，中国粮食安全得到了基本保证，水稻的育种需求也逐步从产量转向了品质(聂元元等,2015)»直链淀粉含量(amylosecontent,AC)是评价稻米品质的关键指标之一(Wanietal.2012),国家优质稻谷标准要求一级优质釉稻谷直链淀粉含量在14%~24%,适用于加工的水稻品种直链淀粉含量在24%以上为优。

水稻胚乳中的直链淀粉由水稻淀粉合成酶(granualeboundstarchsynthaseI,GBSSI)催化合成，水稻蜡质基因水稻Wx基因在20世纪90年代由Wang等(1990)克隆获得,其位于6号染色体短臂，包括14个外显子和13个内含子(Wangetal.1990)。之后的研究发现基因在水稻中含有多个等位变异类型，包括Wx'-.Wx^wxyWx^.Wx'^.W0等。研究发现，水稻品种R15中含有控制高含量直链淀粉合成的蜡质基因Wx°＞水稻品种Y58S含有等位基因Wxb(Shengetal.2015)。是常存在于釉稻中的鼻基因，控制高含量直链淀粉的产生,甲妒能够转录出大量成熟mRNA,进而翻译大量GBSSI酶，促进直链淀粉合成(Caietal.,1998;Jamesetal.2003);Wxb基因所转录的前体RNA难以被剪切编辑，后期成熟mRNA的合成效率较低,GBSSI酶生成较少。因此含有W*基因的水稻品种中直链淀粉含量较低(Mikamietal2008;朱霁晖等,2015)«简化基因组测序(reduced-representationgenomesequencing,RRGS)是以二代测序为基础，通过酶切打断全基因组，再回收特定的特异性片段并对其进行高通量测序，利用局部信息反映整体基因组结构信息的测序技术(王洋坤等，2014;Andrewsetal.2016)。

常用的RRGS有：复杂度降低的多态序列测序(complexityreductionofpolymorphicsequences,CROPS)、限制性酶切位点相关的DNA(restriction-siteassociatedDNA,RAD)测序、基因分型测序(genotypingbysequencing,GBS)等。RAD-seq技术不需要特别精准的参考基因组数据，它对样品进行低深度的高通量测序，检测出大量的单核昔酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)标记，并利用这些均匀分布在染色体上的分子标记鉴定样品的基因型(Chutimanitsakunetal.,2011;Andrewsetal.,2016)。

SNP是基因组上单核昔酸改变引起的DNA多态性，其特点是数量庞大、多态性丰富；能够有代表性地反映变异位点周围DNA片段的基因型，为样品的基因分型提供便捷、有效的方法(孙正文等,2011)。本研究利用RAD-seq技术对'R15'和'Y58S'进行全基因组测序，开发出71861个均匀分布于全基因组上的SNP标记,平均标记密度达到每5200bp就有一个SNPo同时使用结构性变异(structurevariation,SV)标记来检测基因位点上亲本与子代的基因型。为了选育出口感更软的杂交组合，满足不同消费者对稻米米质的需求,本研究以自主培育的常规中熟晚釉香稻品系'R15'为父本，含吃基因的釉稻温敏不育系'Y58S'为母本，对父本进行定点改良。对每世代材料进行SV标记检测，并对F2,F2BCnF2BC2,BC4F2世代进行RAD-seq检测，最终选育出含有Wxb基因(直链淀粉含量为14%)且其余基因组背景和'R15'大致相同的香稻新品系——'深华R16'。

1结果与分析

1.1SNP标记与SV标记选择

通过分析'R15'与'Y58S'及其测配F2代材料全基因组数据，得出大量SNP位点，根据测序深度、位点突变概率过滤得到SNP标记，最终选出71861个可靠的SNP位点俵l)o利用这些位点可以在子代样品全基因组测序后高效筛查出样品的基因组背景信息。在通过PCR与琼脂糖凝胶电泳检测之后，得到最优的SV标记R061067,标记引物序列为R061067(F):AGGTCTGAACCGGTTGGTTT,R061067(R)：TTCTGCCACTGCATCTGCCT«亲本与片代的PCR产物，特异性强，条带清晰，双亲本条带间差异明显，FM弋材料中均出现清晰的双带，说明该分子标记与Wx基因紧密相关，适合用于子代Wx基因基因型筛选（图1）。

1.2携带有必4基因的改良品系的选育

为降低'R15'的AC,选用'Y58S'为供体材料，利用回交、杂交方法将'Y58S'中的吃？基因导入'R15'中。每世代材料进行SV标记检测，并对F2、F2BC1,F2BC2,BC4F2世代进行RAD-seq检测。F2代获得种子593粒，经过SV标记R061067筛选，剔除基因型为a（'R15'基因型）和h（杂合基因型）的株系，剩余的132个株系携带有纯合的Wxb基因（bb）（表2）,对纯合的bb基因型样品进行RAD重测序。以R15的基因型在所有基因组中所占的比例大小为主要依据进行基因组选择，选择Wx基因型为b（'Y58S'基因型）且a基因型（'R15'基因型）占基因组比例高的株系进行后续杂交。其中,a类基因型在F2代染色体组中平均为35.82%,即F2代株系基因组重测序遗传背景平均与'R15'的相似率为35.82%（表3）。F2BG代群体获得72粒种子，经分子标记R061067检测后，72个株系携带有杂合的Wx基因（h）（表2）,对该72个株系进行重测序。a类基因型在F2代染色体组中平均为56.18%（表3）oF2BC2代群体获得59个样品，分子标记R061067检测后，28个株系携带有Wxb基因（表2）,对该28个株系进行RAD重测序,a类基因型在F2BC2代染色体组中平均为88.49%（表3）。