直链淀粉含量是稻米品质的理化指标之一,Wx编码淀粉合成酶I，是调控直链淀粉合成的主要基因。Wx内含子或外显子的改变都会影响蛋白质功能和基因的表达(陈雅玲和包劲松，2017)。水稻中已经报道了7个Wx的等位基因和功能位点，包括WxWx%、Wx、WxP、Wx"、Wxn等(Francesetal,1998;Inukaietal,2000;Bergmanetal,2001;Satoetal,2002;LarkinandPark,2003;Mikamietal.,2008;Liuetal,2009)。在非糯性水稻中,直链淀粉含量较高的籼稻以Wxe为主，直链淀粉含量较低的粳稻以Wx为主(Sano,1984;Wangetal,1995)。

米饭香味是影响食味品质的重要因素之一,具有芳香味的稻米受到消费者和市场的欢迎，通过研究证实2-AP是茉莉香米的主要香味成分(Grimmetal.,2001)。Bradbury等(2005a)克隆了香味基因Badh2,该基因位于第8染色体，编码甜菜碱醛脱氢酶,序列分析表明，突变体存在8碱基缺失,从而导致蛋白提前终止翻译。由于香稻中Badh2基因功能丧失,不能催化4-氨基J醛的氧化，.从而导致4-氨基丁醛积累,促进了2-AP的合成,从而产生香味。基因组定点编辑技术是农作物改良的重要工具,具有省时、高效、还能有效地避免累赘连锁效应(Belhajetal,2015;严芳和周焕斌，2016)。

基因编辑技术只是对内源基因进行编辑或定点突变,在编辑后的突变体中,通过遗传分离完全可以排除外源元件,避免了传统转基因导致的生物安全评价问题。CRISPR/Cas9系统是最近几年发展的一.种准确、方便、高效的基因组编辑方法，在农作物的优良和品质改善等方面具有较高应用价值(涂万富等,2016)。本研究利用华南农业大学刘耀光实验室构建的植物多靶点CRISPR/Cas9载体(Maetal.,2015a),对负调控直链淀粉含量基因Wx、负调稻米香味基因Badh2fer)进行定点突变,获得品质较好优质稻种质资源。

1结果与分析

1.1Wx.Badh2靶位点的设计及CRISPR/Cas9载体的构建

为了得到不同直链含量的打靶后代株系,将Wx基因分别在5"UTR内含子剪切点和编码区序列(CDS)3'的第13外显子设计两靶点，靶点1序列:CATCAGGAAGAACATCTGCAAGG;靶点2序列:AACTGGGAGAATGTGCTCCTGG;为了得到不同浓度香味的打靶后代株系，分别在Badh2的编码区序列(CDS)的第3外显子和第9外显子处设计两靶点。靶点1序列:TAGACTAGAGACGCTTGATTGTGG;靶点2序列:CCAATGGCCAGATTTGCAGTGCA,靶点接头引物与酶切后sgRNA-osU6a和sgRNA-0S-U6a经过两轮PCR扩增(图1),第--轮PCR扩增序的列大小分别为629bp和515bp(图2),组装sgR-NA表达盒到pYLCRISPR/Cas9载体，经过酶切和测序验证后(图3),分别把构建好的2个CRISPR/Cas9载体通过农杆菌介导的遗传转化方法导入水稻‘中早35'受体品种当中,转化后，共获得27株阳性T。代转化苗。其中编辑Wx基因为14株，编辑BADH2基因为13株。

1.2转化植株T。代突变情况检测

T。代共获得27株阳性转化植株,其中编辑Wx的阳性植株为14株，编辑Badh2的阳性植株为13株。根据对T。代单株测序结果，Wx基因的突变频率为57.1%，靶点1纯合突变有3个,双等位突变2个,杂合突变1个;靶点2纯合突变1个,双等位突变3个,杂合突变2个。Badh2基因突变频率为46.2%,靶点1纯合突变有1个,双等位突变2个,杂合突变1个:靶点2纯合突变2个,双等位突变1个,杂合突变1个(表1)。