随着纳米珍珠粉（nano-pearlpowder，NPP）在骨组织工程中的应用推广，粉体纳米珍珠粉应用逐渐增多，其对细胞活性影响的研究也逐渐增加。骨髓间充质干细胞除了具有自我修复更新和成骨分化能力，还对多种材料具有良好的适用性。细胞毒性评估是研究材料生物学行为的基本步骤，本研究拟通过NPP颗粒与小鼠骨髓间充质干细胞体外直接接触培养，检测细胞毒性及细胞凋亡，评估其对细胞活性的影响，为NPP在骨组织工程中的应用提供实验依据。

1材料与方法

本研究于2016年8月至2017年3月在中南大学湘雅医学院附属海口医院实验中心进行。

1.1实验试剂

NPP（课题组自行研制）；纳米羟基磷灰石（nano-hydroxyapatite，NHA）（上海晶纯生化科技股份有限公司）；C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞、C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基（广州赛业生物科技有限公司）；CellCountingKit-8（Dojindo，日本）；FITCAnnexinⅤApoptosisDedectionKitⅠ（BD，美国）；0.25%胰蛋白酶溶液（Sigma，美国）；磷酸盐缓冲液（1×PBS，无钙镁）（Hyclone，美国）。

1.2实验分组

取适量NPP和NHA分别与完全培养基按一定比例混合，配制100、300、500μg/mL的混合完全培养基，用于细胞增殖和细胞凋亡检测。NPP组为实验组（分为不同质量浓度的3个亚组），相应质量浓度的NHA组作为对照组，空白组使用新鲜的完全培养基，为阴性对照组。

1.3检测方法

1.3.1CCK8检测

小鼠骨髓间充质干细胞以2×103/孔接种于96孔板，每组均设4个副孔，预培养24h后，NPP组和NHA组分别加入100、300、500μg/mL混合完全培养基，空白组加入新鲜的完全培养基，200μL/孔。培养24h后，加入20μL/孔CCK8检测液，孵育4h，用酶标仪测定450nm吸光度值（OD值），计算细胞相对增殖率（relativegrowthrate，RGR），评定细胞毒性。RGR=（待测组OD值/空白组OD值）×100%。参照文献进行细胞毒性分级：0级，RGR≥100%；1级，75%≤RGR<100%；2级，50%≤RGR<75%；3级，25%≤RGR<50%；4级，0≤RGR<25%；5级，RGR=0。0或1级为无细胞毒性；2级为轻度细胞毒性；3~4级为中度细胞毒性；5级为明显细胞毒性。实验结果为0或1级反应为合格；2级反应，观测细胞形态，联合评定；3~5级反应为不合格。