牛肉产品深受消费者喜爱，然而在牛肉产品中掺入猪肉的事件常有报道，如使用猪肉制作假牛肉干、牛肉丸等。汕头还因此出台了DBS44/005—2016食品安全地方标准汕头牛肉丸，规定牛肉含量需大于90%。牛肉产品中掺伪猪肉不仅损害了消费者权益，若是在清真食品中出现掺伪则会破坏少数民族饮食禁忌。在肉类掺伪检测中，最常见的是实时荧光PCR法，同时该方法也是目前标准中主流的检测方法，但是该方法需要昂贵的实时荧光PCR仪，并且由于其检测灵敏度极高，对环境分区、器皿、人员操作等防污染措施要求很高，不利于现场快速检测。快速检测技术的特点是时间短、仪器设备要求低，能携带到现场实时监测。

研发肉类食品动物属性现场快速鉴别方法，可为肉类食品掺伪事件的执法提供有力的技术支撑，同时也方便了企业对进货原料进行自我监测。重组酶聚合酶扩增技术(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)为实现这一设想提供了可能性，该技术模拟体内DNA复制机制，利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶代替了传统PCR的热循环解链过程，实现了较低温度(37℃～42℃)核酸快速(15min～20min)扩增。目前该技术在致病菌、病毒、转基因成分、肉类真伪的检测都有一定的应用。本研究在荧光RPA技术基础上，设计RPA扩增引物以及exo荧光探针，实现特异性检测猪DNA成分。

1材料与方法

1.1材料与试剂

牛肉产品：市售；核酸快速提取试剂盒：TaKaRa公司，货号9178；核酸提取试剂盒：QIAGEN公司，货号69514；荧光RPA反应试剂：TwistAmpexo公司；引物、探针。

1.2仪器与设备

T8便携式基因扩增与荧光检测仪：Axxin公司；恒温混匀仪：ThermomixercC公司；5424R小型高速离心机：Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1DNA提取

一步法快速提取DNA：使用核酸快速提取试剂盒(TaKaRa，货号9178)，按照说明书操作。柱提法提取DNA：使用核酸提取试剂盒(QIAGEN，货号69514)，按照说明书操作。

1.3.2实时荧光PCR反应

按照SN/T2051—2008标准中规定的猪DNA成分检测方法。

1.3.3RPA引物及exo探针设计

NCBIGenbank数据库中下载猪(KF888634.1)细胞色素C氧化酶亚型I(COI，cytochromeCoxidasesubunitI)基因序列，将核酸序列在NCBI网站使用BLAST功能寻找特异性序列。在特异性序列上设计exo探针，并在exo探针序列周围分别设计上下游引物各2条。

1.3.4荧光RPA反应条件

按照TwistAmpexo试剂盒说明书操作。反应体系(50µL)：正向引物(10µmol/L)2.1µL，反向引物(10µmol/L)2.1µL，exo探针(10µmol/L)0.6µL，水化液29.5µL，灭菌超纯水12.2µL，醋酸镁溶液(280mmol/L)2.5µL，DNA模板1µL。反应程序：39℃15min。结果判断：15min内，扩增曲线发起且达到荧光信号强度达到5000mV以上可判定检测结果为阳性；否则，判定检测结果为阴性。

1.3.5RPA引物的筛选

固定上游一条引物，与下游两条引物分别组合，结合exo探针，进行扩增反应，并设置空白对照。确定一条下游引物后，再与上游两条引物分别组合，结合exo探针，进行扩增反应，并设置空白对照，最终确定最佳上下游引物组合。

1.3.6特异性实验验证

一步法快速提取猪、家牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、鸡、鸭、鹅、狗、驴、马肉DNA，并验证其特异性。

1.3.7灵敏度实验

验证将牛肉和猪肉分别使用粉碎机处理后冻干，分别混合成含猪肉含量为0.1%、1%、10%、20%、50%、80%、90%、100%的混合样品。按1.3.1提取DNA，按照1.3.4扩增反应。

1.3.8样品测试

通过一步法对40批次牛肉产品(含鲜冻牛肉、牛肉干、酱卤牛肉等)快速提取核酸，对比研发的exo探针-RPA法及标准方法检测结果，以探讨检测方法的准确性。