光呼吸是植物中除光合作用以外的第二大代谢流，光呼吸代谢起始于2-磷酸乙醇酸的生成，2-磷酸乙醇酸经磷酸酶水解成乙醇酸(GLC)并被运至过氧化物酶体从而进入光呼吸乙醇酸代谢途径。

乙醇酸氧化酶(Glycolateoxidase，简称GLO，EC1.1．3．15)是一类黄素蛋白氧化酶，在光呼吸途径中，GLO负责氧化乙醇酸生成乙醛酸(GLX)并产生等量的H2O2。已知GLO普遍集中在绿色植物的叶片表达，其他部位表达量较低。GLO活性的变化不但直接调节着植物光呼吸速率还对植物光合作用有着间接的调控功能。例如，抑制GLO可导致水稻光合速率下降，而过表达GLO则可提升高光高温条件下水稻的光合速率。此外，GLO在植物逆境响应过程中也具有重要功能，植物的GLO活性可被各种环境胁迫所诱导，在干旱胁迫条件下烟草(Nicotianatabacum)、豌豆(Pisurnsativurn)及豇豆(Vignacatjang)中GLO活性均显著上升。

在植物抵御病原菌入侵过程中GLO活性也存在上调现象。Ｒojas等发现烟草及拟南芥(Arabidopsisthaliana)的非寄主抗性与GLO氧化乙醇酸生成的H2O2紧密相关。而Noctor等证实C3植物中约70%的H2O2来源于光呼吸中的乙醇酸氧化过程，且在干旱及高温等逆境条件下这一比例会变得更高。因此，GLO可能在H2O2相关的信号途径中发挥着重要功能。Zelitch等首次从菠菜叶中纯化得到了GLO蛋白(SpGLO)，随后的多肽测序进一步鉴定了SpGLO的一级结构，这使得SpGLO成为研究黄素蛋白氧化酶类的最佳模式蛋白。

SpGLO先后在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、毕赤酵母(Pichiapastoris)及汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)中进行过异源表达，此外SpGLO还被用于乙醛酸的生物催化合成研究。然而，目前关于SpGLO的酶学特性研究结果比较琐碎，其全面系统的酶学特性研究还未见报道。此外，SpGLO同工酶的种类仍存在争议，并且适合SpGLO的同工酶电泳方法也一直未见报道。

本研究克隆了SpGLO基因，将其在酿酒酵母中进行了异源表达与纯化，并在现有研究报道的基础上进一步全面系统分析了SpGLO的酶学特性。此外本研究利用改进的GLO同工酶电泳方法，首次通过同工酶电泳技术分析得出SpGLO含有2条GLO同工酶谱带。对SpGLO酶学特性及其同工酶组成的进一步阐明，可望为今后在植物中调节或改造光呼吸代谢进而提高植物光合效率以及研究植物抗逆机制等提供理论依据与切入点。

1材料和方法

1．1材料与试剂

1．1．1试验材料

菠菜(Spinaceaoleracea，Americanhybrid424)、大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α、酵母菌(Saccharomycescerevisiae，INVSC1)(his3Δ1/his3Δ1leu2/leu2trp1-289/trp1-289ura3-52/ura3-52)与酵母表达载体pYES2购自Invitrogen公司。反转录试剂盒PrimeScriptTMII1stStrandcDNASynthesisKit购自宝生物。pMD19-T载体和基因操作相关的酶均购自TaKaＲa公司。蛋白纯化柱(ProfinityTMIMACresincolumn，10×64mm)购自Bio-Ｒad公司。其他基因操作相关的试剂盒购自北京天根生物技术公司，其他化学试剂为生工生物产品。

1．1．2培养基

YPD液体培养基:胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，水1000mL;固体YPD培养基添加15g/L琼脂。SC缺陷培养基(缺少尿嘧啶):YNB6．7g，葡萄糖20g，根据酵母表达载体pYES2质粒的基因标记补加16种氨基酸、腺嘌呤，水1000mL;固体SC缺陷培养基添加15g/L琼脂。SC诱导缺陷培养基，在SC缺陷培养基的基础上用D-半乳糖替代葡萄糖。