华蟾素肠溶片是以中华大蟾蜍（ＢｕｆｏｂｕｆｏｇａｒｇａｒｉｚａｎｓＣａｎｔｏｒ）或黑框蟾蜍（Ｂ．ｍｅｌａｎｏｓｔｉｃｔｕｓＳｃｈｅｉｄｅｒ）的干燥表皮为原料，经水煮精制而得的提取物，加适量淀粉和糊精，混匀，制成颗粒，干燥压片，包肠溶糖衣而成，具有解毒、消肿、止痛的功效，用于中、晚期肿瘤，慢性乙型肝炎等症。因抑瘤效果明显，临床应用达３０年之久。蟾毒配基类成分和吲哚生物碱类成分为华蟾素片中的两类主要成分。比较华蟾素肠溶片与蟾皮的化学成分差异发现，在华蟾素肠溶片中含有一低极性化学成分，而该成分在蟾皮药材中未出现。将该成分分离纯化，鉴定为邻苯二甲酸二乙酯。

邻苯二甲酸二乙酯（Ｄｉｅｔｈｙｌｐｈｔｈａｌａｔｅ）属于邻苯二甲酸酯类增塑剂，被广泛用于个人护理用品、化妆品、玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、药品包衣辅料等。邻苯二甲酸二乙酯被人体摄入后，在体内转化为邻苯二甲酸单乙酯（Ｍｏｎｏｅｔｈｙｌｐｈｔｈａｌａｔｅ），邻苯二甲酸单乙酯在尿液中的浓度已成为生物标记物，用于评估邻苯二甲酸二乙酯摄入量。有文献报道称邻苯二甲酸单酯与人体过氧化物酶体增殖剂激活受体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒｓ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＰＰＡＲｓ）三种亚型中的ＰＰＡＲ－γ受体相偶联，从而起ＰＰＡＲ激动剂作用。研究发现，ＰＰＡＲ激动剂可直接发挥抗肿瘤作用，并具有广谱的减缓肿瘤微环境病理恶化，以及抗血管生成，免疫调节作用。经过高压液相色谱分析，推测邻苯二甲酸二乙酯作为华蟾素肠溶片包衣辅料中的增塑剂而被加入制剂处方。

本研究应用柱层析法将其从华蟾素肠溶片中分离纯化，以质谱、核磁共振技术对其进行结构鉴定；同时将华蟾素肠溶片中素片与包衣层剥离，用高效液相色谱法检测华蟾素肠溶片、素片、包衣层中邻苯二甲酸二乙酯和蟾蜍噻咛含量；前期研究发现，相比于水剂，油剂给药可提高华蟾素肠溶片中活性成分在大鼠体内的吸收及小鼠体内抑瘤效果。本期研究考察油或水剂给药对华蟾素肠溶片中邻苯二甲酸二乙酯在大鼠体内被吸收利用的影响；同时将华蟾素肠溶片、素片、包衣层研粉后分散于玉米油中灌胃给药，比较三者在小鼠体内抑瘤活性及对免疫细胞亚群应答水平情况。为进一步验证邻苯二甲酸二乙酯在华蟾素片中可以免疫佐剂形式增强华蟾素体内的抑瘤活性，本研究通过重新刮取华蟾素肠溶片包衣粉末（不含或含微量华蟾素成分）分散于玉米油或水中，以纯度９９％的邻苯二甲酸二乙酯的玉米油剂作为对比，考察邻苯二甲酸二乙酯在小鼠体内的抑瘤效果及给药溶剂的影响。

１材料与方法

１．１邻苯二甲酸二乙酯的分离纯化及结构鉴定

１．１．１材料与仪器

１．１．１．１药品与试剂

华蟾素肠溶片，购买于安徽华润金蟾药业股份有限公司；层析硅胶（３００～４００目、１００～２００目）和ＧＦ２５４薄层板，青岛海洋化工；ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０凝胶柱色谱填料，ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ；甲醇、石油醚、乙酸乙酯，分析纯，北京化工厂；乙腈、甲酸色谱纯，美国ＦｉｓｈｅｒＣｈｅｍｉｃａｌ。

１．１．１．２仪器

ＷＤ－９４０３Ｃ紫外仪，北京六一科研仪器；Ａｇｉｌｅｎｔ６１２５ＥＳＩ－ＭＳｎ，美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司；ＷａｔｅｒｓＣＯＲＴＥＣＳＣ１８＋色谱柱（２．７μｍ，４．６×３０ｍｍ），美国Ｗａｔｅｒｓ公司；ＢｒｕｋｅｒＡＶＡＮＣＥ６００核磁共振仪；旋转蒸发仪ＥＹＥＬＡ东京理化。

１．１．２实验方法

分离纯化及化学结构鉴定：取华蟾素肠溶片２０ｇ，研粉后用２００ｍｌ甲醇超声萃取１小时过滤，收集滤液。将滤液浓缩至约５０ｍｌ与１０ｇ１００～２００目层析硅胶混匀，干燥去除甲醇。将载样硅胶装于３００～４００目层析硅胶色谱柱上，以石油醚（ＰＥ）∶乙酸乙酯（ＥＡ）＝５∶１流动相洗涤层析柱，ＧＦ２５４ＴＬＣ检识（展开剂ＰＥ∶ＥＡ＝５∶１），收集ＲＦ＝１／３暗斑流份并回收有机溶剂。浸膏用微量甲醇溶解，经ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０凝胶柱色谱纯化，ＧＦ２５４ＴＬＣ检识（展开剂ＰＥ∶ＥＡ＝５∶１），收集ＲＦ＝１／３流份暗斑流份且回收有机溶剂，得油状透明液体。