邻苯二甲酸二(2一乙基己基)酯[di(2-ethylhexy1)phthalate，DEHP]作为塑料的增塑剂被广泛应用于家居用品、食品包装材料、婴儿玩具、化妆品、药品中n]。由于在塑料薄膜的制造过程中，未聚合到聚氯乙烯高分子的碳链上，可缓慢挥发至大气、土壤和水中，造成对环境的污染，进而对生物体引起有害健康的效应。有研究显示l2在烹调油中可检测出DEHP及其他酞酸酯类增塑剂，食品包装材料中的增塑剂会迁移进入食用油及各种食品中。

以往对DEHP的研究主要集中在生殖毒性、胚胎毒性、发育毒性_3蚓，而对脑发育、神经毒性方面的影响研究较少。有研究认为DEHP可干扰神经类固醇水平，影响神经类固醇对于学习记忆、认知功能的调控作用，从而影响学习记忆认知功能。但目前DEHP导致神经毒性的机制尚不明确，且大部分研究限于动物研究阶段。本实验拟从细胞水平，通过研究DEHP对皮层神经元细胞毒性以及对钙稳态的影响，探索DEHP的神经毒作用及可能机制。

1材料与方法

1．1实验动物

健康清洁级孕l7～18d的SD大鼠，购于江苏省实验动物中心。

1．2实验材料

DEHP溶于二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)中，配置成浓度为100mmol／L的母液，一20℃保存，加药前用细胞培养液稀释至所需浓度。

1．3细胞培养试剂

谷氨酰胺、多聚赖氨酸为美国Sisma公司产品；DMEM／12培养基为Hyclone公司产品；马血清、胎牛血清、Neurabasal为美国Gibco公司产品。培养基使用参照文献，种植培养基：高糖型DMEM／12，10％马血清，10％胎牛血清，青霉素100U／ml，链霉素100U／ml；维持培养基：Neurabasal培养基(美国Gibco公司)，青霉素100U／ml，链霉素100U／ml，谷氨酰胺0．5mmol／L。Hank’S平衡盐溶液，PBS缓冲液均为配制溶液。MTF(全称：溴化一3(4，5一二甲基噻唑基一2)一2，5一二苯基四唑，美国Sigma公司)。EDTA(乙二胺四乙酸，美国Hyclone公司)。NaC1，KC1，KH2PO，NaHCO3，Na2HPO4，NaOH均为国产分析纯。

1．4主要仪器

CO2培养箱(美国ThermoScientific公司，型号：ThermoScientificSeries8000系列一3423)；离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司，型号：TDZ6B—WS)；倒置显微镜(日本Olympus公司，型号：CK40一F200)；全自动酶标仪(美国DynexTechnologies公司，型号：MRX)；净化工作台(SW—CJ一2F，中国苏州)，LSM510型激光共聚焦、显微镜(LSM，德国Zeiss)。

1．5细胞制备

实验前所有器械均经过高压灭菌。取孕17～18d的SD大鼠，在10％水合氯醛(03ml／100g)麻醉后，碘伏消毒腹部，打开腹腔，取出胎鼠及其子宫置于冰的DMEM中。在解剖显微镜下，剥离脑膜以及血管，夹取大脑皮层置人另一含有DMEM的培养皿中。眼科剪将其剪成糜状(1mm)，吸管吸人离心管中，离心1200r／min，5min，吸取上清液，加入含有0．02％EDTA的0．25％胰酶5ml进行消化，37℃水浴锅中轻摇10min，终止消化，离心1200r／min，5rain，用DMEM漂洗两遍，轻轻吹匀，离心1000r／nain，3min，弃上清，DMEM10ml，缓慢吹匀，200目尼龙网筛网过滤，所有操作均在无菌环境下进行。细胞接种至24孔板，稀释细胞悬液至适当浓度，摇匀后每孔接种适当细胞悬液。接种的24孔板放置5％CO+95％0：37℃培养箱中培养。

1．6皮层神经元鉴定

取培养7d的皮层神经元，PBS漂洗，4％多聚甲醛固定15min，0．3％Triton透化处理10min，PBS漂洗，5％FBS封闭60min。分别加入兔抗NSE(神经元特异性烯醇化酶，1：200)4~C过夜。次日：加入FITC标记的山羊抗兔IgG(1：100)，37~C孵育40min，最后加入5ixg／LHoechst33258显色10min。在倒置相差荧光显微镜(×100)观察，计算原代培养皮层神经元标记蛋白NSE阳性细胞所占比例。