体内药物分析方法的建立与验证

主讲人： 山西医科大学    曹洁 博士

一、体内药物分析方法的建立

1. 分析方法的选择

分光光度法：紫外-可见、荧光、原子吸收

薄层色谱法：紫外扫描、荧光扫描

气相色谱法：NPD、FID、FPD、MS

液相色谱法：紫外、荧光、电化学、MS

免疫法：放射免疫法、酶免疫法等

色谱-质谱联用技术

2. 分析方法建立的一般程序

做好文献总结

充分了解药物在机体内状况：pH值、亲脂性、溶解度极性、光谱特征、药动学参数、体内代谢情况

明确测定目的和要求：药物浓度监测、药代动力学研究、母体药物和代谢物

结合实验室条件：设备条件、预处理方法

体内药物分析方法建立的一般流程

样品        前处理方法       样品测定       方法学研究

示例：氯化琥珀胆碱的检测

乙腈稀释后过膜，液相色谱-质谱联用仪分析

检测条件的选择

标准物质和内标照拟定的分析方法测定，确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度；

HPLC：选择检测器、色谱柱、流动相、进样量等，优化参数，得到足够的方法灵敏度

分离条件的选择

空白溶剂试验：溶剂(方法特异性)      

 空白生物基质试验：endogenous (方法特异性)      

 模拟生物样品试验：方法效能指标      

 实际生物样品测试 ：代谢产物(方法特异性)

空白溶剂试验

待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液）

采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等样品预处理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等）

测定响应信号（如HPLC峰面积或峰高）

考察目标

方法的特异性

与内标分离

空白生物基质试验

空白生物基质 (blank biological matrix)

照 “空白溶剂试验” 方法操作

考察目标：

生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）

在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗”（信号附近的有限范围）内不应出现内源性物质信号

模拟生物样品试验

模拟生物样品(质量控制，QC样品)

空白生物基质中加入待测药物照 “空白溶剂试验” 方法操作

考察目标

方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度

药物的萃取回收率等各项技术指标

同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性

实际生物样品的测试

实际生物样品

空白生物基质和模拟生物样品试验确定的分析方法及其条件是否适合于实际生物样品的测定

药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物)或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物)

确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试

考察目标：

代谢产物对药物、内标物质的干扰情况

进一步验证方法的可行性

二、分析方法验证的内容与要求

用于实际生物样品分析之前验证 (validation) 分析方法的可行性与可靠性

方法验证时应考虑影响分析方法所有可变因素(采样,样品制备,色谱分离,检测与数据评价等)

使用的技术指标效能指标

使用的样品通常采用模拟生物样品和用药后的实际生物样品

分析方法的验证的目的：证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析物浓度的可靠性。

包括：选择性、精密度与准确度、回收率、定量限与检测限、线性范围、稳定性、基质效应、延迟效应、残留等。

1. 选择性（selectivity）

又称专属性或特异性(specificity)

指样本中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一的测定分析物的能力。

应使用至少6个不同来源的空白基质，观察色谱出峰情况，检查在目标物出现的区域是否存在干扰。

如存在干扰，可采取优化仪器条件、优化前处理方法、改变色谱条件等措施来消除干扰。若确实存在少量干扰物质不影响定量分析结果，应证明定量限的准确度和精密度在可接受的限度内。

考察一个分析方法是否具有特异性，应考虑以下几点：

内源性物质（基质）的干扰：比较对照品、空白生物基质、模拟生物样品（空白生物基质添加对照品）检测信号；

未知代谢物的干扰：模拟生物样品与用药后实际生物样品的检测信号；

配伍用药物的干扰

色谱法至少要提供空白样品色谱图、模拟生物样品及用药后的生物样品色谱图。

示例：尿液中THC-COOH的检测

2. 残留（延迟效应）

延迟效应可影响后续样品的分析结果，特别是测试样批量分析时，延迟效应可能造成定性、定量分析结果的不准确。

在高浓度的样品或者校准曲线最高浓度点样品后紧接着分析空白样，并通过空白样来评价延迟效应。宜重复测定 3 次。

残留应不超过定量下限的20%，且不超过内标的5%。

如不可避免，应考虑控制措施，确保不影响准确度和精密度。

3. 标准曲线与线性范围

校准曲线（calibration curve）或标准曲线（standard curve）

在指定的浓度范围内评价仪器对分析物的响应，获得标准曲线。

用模拟生物样品建立（与待测药物相同基质）

应根据测试样品的预期浓度或含量范围确定标准曲线的线性范围。

线性范围应能覆盖全部生物样品的药物浓度。

应包含一个空白样（不含目标物和内标的基质样品）、一个零点样品（空白样加内标）和一定梯度的 6 个以上浓度点样品。

通常为线性模式，用回归分析方法所得的回归方程来评价。

回归分析法为最小二乘法（least squares）或加权最小二乘法（weighted least squares）

模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。

RSD＜15%，定量限处在20%范围内。色谱法要求相关系数R＞0.99

如果一条校准曲线在最低浓度到最高浓度范围内不能满足相关要求，可考虑分多段制作校准曲线。

4.准确度和精密度

  准确度（accuracy）：是指确定的分析条件下，测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度。使用模拟生物样品（质控样）测定。

通常用相对回收率（relative recovery, RR）或相对偏差（relative error, RE）来表示。

测定：取高（接近上限）、中、低、定量限三个浓度，每浓度至少5个样本，与随行校准曲线同法测定，计算方法回收率。

计算：测定值M（measured）平均值与理论浓度（added）的比值。

要求：相对回收率应在85%~115%（LOQ附近80%-120%），RE±15%（LOQ附近± 20%）

精密度（precision）：每次测定结果与多次测定平均值的偏离程度。

用标准偏差(standard deviation，SD)或相对标准偏差(relative standard deviation，RSD) 表示，相对标准偏差也称变异系数（CV）

包括为日内（批内）精密度和日间（批间）精密度。

生物样品定量分析方法的RSD应控制在15%以内，在定量限处RSD应小于20%。

分别在同一批内和不同批间制备高、中、低、定量限4个浓度的QC样品，并分析测定，每浓度至少5个样本，测定3天。

表示该分析方法的可重复性(reproducibility)

5.检出限和定量限

检出限(limit of detection, LOD)：S/N ≥ 3（定性分析）

定量限(limit of quantitation，LOQ)，又称为方法灵敏度(sensitivity)

系指在保证准确度与精密度符合要求的前提下，能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度

标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点≥LOQ)或信噪比≥10的最低浓度

要求：

1. 应能满足测定3～5个消除半衰期后生物样品中的药物浓度           

2. 准确度在80%～120%(或RE在±20%的范围内)               

3. RSD＜20%

6. 萃取回收率（提取回收率）

萃取回收率(绝对回收率，absolute recovery)，

重点考虑方法准确度(或相对回收率)，操作简便、快速

萃取回收率一般应≥50%

高、中浓度的RSD应≤15%，低浓度的RSD应≤20% 萃取回收率与相对回收率的意义不同：

萃取回收率考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失，相对回收率采用标准曲线准确计算生物样品中药物浓度。

7. 基质效应（matrix effect）

基质效应是LC-MS分析时存在的一个非常明显的现象，表现为离子增强或抑制作用。

基质效应可与提取回收率同时考察。

应使用至少6个不同来源的基质，高、低浓度，变异系数＜15%

8. 稳定性

分析药物和内标储备液及工作溶液的稳定性；

冻融稳定性：-20℃ 24h，室温24h，3个冻融循环

长期稳定性：存放时间和条件

处理后样品的稳定性：室温或保存条件，自动进样器

要求：准确度85%～115%(RE在±15%范围内)，RSD＜15%

三、应用示例

毛发中滥用物质的检测

1.标准物质溶液配制

精密称量吗啡、O6-单乙酰吗啡、甲基苯丙胺、苯丙胺、氯胺酮、可卡因、苯甲酰爱康宁和甲氧那明（内标）标准物质各10mg于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配制成1.0mg/mL的标准储备溶液，密封，4℃冰箱保存。

试验中所用其他浓度标准工作溶液均由上述标准物质溶液用甲醇稀释而得：甲氧那明（ 1ng/mL工作液）。    

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2. 样品前处理

待测样品：待测毛发样品依次用适量的水和丙酮振荡洗涤两次，晾干后剪成约1mm段，置冷冻研磨仪中粉碎，呈粉末状。称取毛发粉末20mg，加入1.0mL内标甲氧那明标准工作液（甲氧那明1ng/mL），冰浴超声30min，离心，移取上清液，于60℃水浴空气流下吹干。残留物用100μL甲醇复溶，供仪器分析。

空白样品：空白毛发样品20mg，添加内标，按上述方法处理，与待测样品平行提取操作。

添加样品：空白毛发样品20mg，添加对照品（LOD）和内标，按上述方法处理，与待测样品平行提取操作。

3. 仪器检测

Agilent 6460液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS），配有电喷雾离子源（ESI）

3.1 液相色谱条件

色谱柱为Restek Allure PFP Propyl（2.1mm×100mm，5μm）液相色谱柱；流动相A为乙腈，B为20mmol/L乙酸铵和 0.1 %甲酸缓冲液，流动相洗脱梯度见表，流速为0.35mL/min，柱温为室温；进样量为5µL。

3.2 质谱条件

离子源为电喷雾电离-正离子模式（ESI+），多反应监测（MRM），离子源电压（IS）为5500V。