壬基酚聚氧乙烯醚(nonylphenolethoxylates,NPEO)由壬基酚(nonylphenol,NP)和环氧乙烷加合而成,是全球使用量第二大的商用非离子表面活性剂。因其性能稳定、耐酸碱且价格低廉,被广泛应用于洗涤剂、化妆品、纺织、造纸、印刷、农药、制药、冶金、石油、合成橡胶、塑料甚至食品等产品的加工和生产。

近些年来,全球NPEO的年产量大约70万t。随着工业和农业的迅速发展,NPEO可以通过各种途径释放到环境中。但在自然环境中,NPEO通常会降解成短链壬基酚聚氧乙烯醚、壬基酚和羧酸衍生物。因此,这些降解产物经常会在废水、地表水和沉积物中被检测到，NPEO及其降解产物对环境的潜在影响受到人们的广泛关注。NP已被证实具有很强的雌激素活性,被称为内分泌干扰物(endocrinedisruptingchemicals,EDCs)。NPEO及其降解产物大量进入环境中,会对人体正常的激素分泌产生影响,造成致畸、致癌和致突变效应,还可以通过食物链在动物和人体内积聚。研究表明,EDCs可以通过与天然激素相结合、模仿天然激素作用等方式引起内分泌紊乱,对生物的发育和生殖产生影响,导致产卵量下降。截至目前,国内外已对NPEO降解产物NP开展了多项毒性效应研究,低浓度的NP能够抑制虹鳟鱼的生长发育。

NP作为一种环境雌激素,能与雌激素受体结合,促使鱼类体内卵黄蛋白原(vitellogenin,VTG)的升高。刘晓丽等定量研究了NP对成熟雄性斑马鱼性腺细胞色素P450酶系表达的影响,发现NP可以通过抑制精巢中雄激素合成相关酶基因的表达影响精巢发育。但关于NPEO对鱼类精巢组织结构影响的研究不多,NPEO对鱼类性腺发育影响的机理还不是很清楚。因此,本实验以成熟雄性斑马鱼(Daniorerio)为实验材料,探究不同浓度NPEO暴露对受试鱼性腺中类固醇激素受体基因(ERα和AR)以及细胞色素P450酶基因表达量的影响,观察斑马鱼精巢组织结构的变化,深入探究NPEO对成熟雄性斑马鱼精巢组织结构影响的作用机制。

1材料与方法(Materialsandmethods)

1.1试剂与仪器

试剂:壬基酚聚氧乙烯醚(分析纯)购自阿拉丁化学公司,乙醇(分析纯)和二甲苯(分析纯)购自南京化学试剂有限公司,丙酮(分析纯)购自上海凌峰化学试剂有限公司,17β-雌二醇(>99%)购自SigmaAldrich公司。仪器:LeicaDM4000B显微镜,Bio-RadExperion全自动电泳系统,Bio-RadGelDocTMXR+凝胶成像分析系统,Bio-RadCFX96TMReal-TimeSystem荧光定量PCR仪,Bio-RadDNAEnginePCR仪。

1.2实验材料和试验设计

斑马鱼购自南京大学模式生物研究中心,为性成熟雄性个体,平均体重(0.315±0.064)g,在环境保护部南京环境科学研究所斑马鱼实验系统中心驯养2周以上,驯养鱼用水为曝气除氯后的自来水,每天定时投喂新鲜孵化的卤虫无节幼体(Artemianauplii)。NPEO暴露设计:NPEO较难溶于水,需以丙酮作为助溶剂,配制成的母液浓度为500mg·L-1(丙酮:5.0mL·L-1)。设置5个试验浓度组,分别为0.001、0.01、0.1、1.0和10.0mg·L-1,设置雌二醇(E2:80.0μg·L-1)试验组、空白对照组和溶剂对照组。试验在10L(含8L暴露液)的玻璃缸中进行,每个试验组设3组平行,每组平行随机放入试验用鱼30尾。采用半静态水体暴露的方式进行试验,试验期间每天喂食3次,48h更换一次暴露液,水温控制在(25±2)℃,光照周期14h∶10h,暴露周期为21d。暴露21d后取样,取样时将斑马鱼置于冰上,冻僵后迅速取精巢,立即放入液氮中速冻,放在-80℃冰箱中保存待用,精巢组织学研究的样品用4%多聚甲醛固定待用。

1.3斑马鱼精巢中相关基因的表达

采用高纯总RNA快速抽提试剂盒(离心柱型)提取雄性斑马鱼性腺组织总RNA,取1μL总RNA根据HiScriptTM1STstrandcDNASynthesiskit的说明进行反转录,使用CFX96TMReal-TimeSystem进行实时荧光定量PCR检测,实时荧光定量PCR反应体系为20μL,其中包括10μLFaststartUniversalSYBRGreenMaster,4μLcDNA模板(反转录后按1∶10稀释),2μL引物(6mmol·L-1),4μLRNasefreewater。反应条件如下:95℃10min,1个循环;95℃10s,55℃3s,40个循环,4℃保存。3次重复实验以减少误差。通过分析反应后各引物的溶解曲线来检测目标片段扩增产物、引物二聚体或DNA污染物情况。用1%凝胶电泳检测目标片段扩增产物的长度(标准化内部参照)。本研究选择β-actin基因作为内参基因,检测雌激素受体α(ERα)、雄激素受体(AR)以及细胞色素P450酶基因mRNA的相对表达量,基因名称、引物序列及序列号见表1。