酶联免疫法快速检测肉制品中的克伦特罗

Elisa的发展  是一类常用的免疫酶技术，将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，用酶标记抗原或抗体，使抗原抗体反应在固相表面进行，检测液体中未知抗体或抗原的方法。

Elisa的定义

 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。    在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。     再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。     加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

在ELISA方法中有三个必要的试剂：

1.固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”（immunosorbent）

2.酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）

3.酶反应的底物（显色剂）

Elisa类别

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法，主要类型有： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法 亲和素-生物素-ELISA法

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，先将已知抗体连接在固相载体上，待测抗原与抗体结合后再与酶标二抗结合，形成抗体-待测抗原-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体原成正比。

间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法

竞争法 当小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的抗体结合位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。

Elisa特点

灵敏度高：ELISA测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶。由于酶的催化效率很高，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色反应，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

特异性高：ELISA的特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性

准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测以及免疫实验分析等领域。

原理

样品中的克伦特罗与酶标板上固定的抗原共同竞争酶结合特异性抗体，通过酶催化显色，根据显色的深浅来判断样品中，克伦特罗的含量，显色深，含量少，显色浅，含量多。

组 份

1.标准品工作液：0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ppb 2.酶标板 3.酶标记物浓缩液（酶标二抗） 4.酶标记物稀释液（一抗） 5.洗涤浓缩液 6.浓缩组织稀释液 7.底物A液、B液 8.终止液 9.盖板膜

注意事项

1.仔细阅读说明书

2.过期的试剂盒不得使用，不同批号的试剂盒不得混用

3.试剂盒使用之前，需要将盒内各组份置于实验台恢复至室温（25 ±2℃）2h

4.样品处理前先恢复至室温，处理完毕后，请立即分析，否则放置时间过长，将影响检测结果的准确性。

5.避免金属类物质盛装和搅拌试剂。

6.试剂使用前请摇匀，混合时应避免出现气泡。

7.底物A、B液若使用前变成蓝色，或混合后立即变蓝，说明试剂已经变质。

8.板孔中加入样品溶液、酶标记物工作液、AB液混合液、终止液各步骤时间不超过3min。

9.检测时，应尽量减少酶标板上方空气流动。 10.检测过程中所用枪头不得重复使用。

样品前处理

复溶液 将复溶液用去离子水10倍稀释 （1份复溶液+9份去离子水） 4℃保存1个月。 工作洗涤液 将浓缩洗涤液20倍稀释 （1份浓缩洗涤液+19份去离子水）

组织（稀释系数：4） 方法1 称取2±0.05g均质后的样品于50mL离心管中； 加入6mL复溶液； 充分振荡2min； 4000g以上，离心10min；      （若组织中样本中油脂含量较高，可在振荡之后放入85℃水浴10min后再离心） 立即取50μL上清液进行测定。

组织2（稀释系数：4） 称取2±0.05g均质后的样品于50mL离心管中；加入6mL乙腈-0.1M HCl，充分振荡2min，4000g以上，离心10min； 取上清液3mL，加入2mL 0.1M NaOH，加入6mL乙酸乙酯，充分振荡2min，4000g以上，离心10min，取全部上清在50-60℃条件下氮气或空气流吹至完全干燥。 加入1mL复溶液混合振荡30s，取50μL上清液进行测定。

饲料（稀释系数：10） 称取1±0.05g均质后的样品于50mL离心管中；加入10mL甲醇，再加入5g无水硫酸钠，充分振荡2min，4000g以上，离心10min； 取上清液1mL，在50-60℃条件下氮气或空气流吹至完全干燥； 加入1mL复溶液溶解干燥残留物，再加入1mL正己烷混合30s，4000g以上，离心5min； 取50μL下层进行测定。

尿液 （稀释系数：1） 直接取50μL清亮尿液进行测定。 浑浊尿样需要过滤或经4000g以上，离心5min，以得到清亮尿液 冷冻保存

检 测

1.加入标准品、样品 2.加入酶标记物 3.加入抗体工作液 4.第一次孵育 5.洗涤 6.底物显色 7.二次孵育 8.终止 9.酶标仪操作

计 算

百分吸光率的计算    标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%。 标准曲线的绘制与计算       以标准品百分吸光率为纵坐标，以克伦特罗标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。 样品含量计算         将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克伦特罗实际残留量。