北方伟业计量集团有限公司
内容提要
核酸检测的特点
核酸检测的应用
核酸检测实验室建设
质量控制
一、核酸检测的特点
个体水平——多细胞,例如:寄生虫个体和卵,优点直观,需要经验非常丰富 的人员
细胞水平——红细胞和白细胞的计数,分离到具体的微生物菌体,呈现的形式菌落和菌体个体,优点是直接,需要经验非常丰富的人员,存在的风险是微生物容易变异,包括菌落形态变化(菌落由光滑型-粗糙型,在显色培养基上显色不正确等),生化性状改变
分子水平:1.蛋白质水平:糖尿病人的糖化血红蛋白指标,肿瘤标志物指标等; 微生物蛋白质谱图,不是以某一个蛋白作为特异性的指标,而是以蛋白图谱的为鉴定依据,MRSA菌株是以特异性的蛋白峰作为鉴定依据。
2.核酸水平:(1)DNA检测:遗传疾病的筛查;食品微生物检测特异性基因,溯源、分型等。
(2)RNA检测:RNA病毒的检测,新冠病毒检测;细菌mRNA 的检测等。
核酸检测的特点:1.DNA核酸检测。(1)优点节约时间,可以从增菌液直接检测。
(2)缺点存在假阳性和假阴性。假阴性原因:培养基中存在PCR抑制剂,对PCR扩增有一定的影响;目标菌体的靶序列缺失。假阳性原因:存在非特异扩增。
2.转基因GMO:检测的是插入序列,样品核酸提取是检测的关键,特别是加工食品
核酸PCR检测的特点:
核酸检测的结果可以作为最终判定依据吗?
转基因产品核酸检测:yes
遗传病的筛查:yes
不可培养病毒核酸检测:yes,
例如:诺如病毒 致病微生物是否含有毒力、耐药、致病基因: yes
分型和溯源:yes
判定目的基因是否存在!!!!
核酸检测的特点
核酸检测的结果可以作为最终判定依据吗?
是否存在具有感染性的病毒颗粒:NO
是否存在有活性目标微生物:NO
为什么:1.病毒核酸阳性,证明这个病毒来过并留下了印记,并不能证明依然具有病毒颗粒
如何证明核酸阳性的样本依然具有感染性:分离培养,拿到直接的证据
核酸检测的结果可以作为最终判定依据吗?
是否存在具有感染性的病毒颗粒:NO
是否存在有目标微生物:NO
细菌核酸阳性:有菌体存在
有死的菌体存在,游离目标核酸 有非特异扩增(需要排除)
二、核酸检测的应用
核酸检测的应用——非常广泛。
转基因及其产品 种子、农作物 产品中最难检测:油、改性淀粉等 、病毒检测、DNA病毒、RNA病毒、食源性致病微生物、特异性目的基因 、毒力基因 、耐药基因 、致病基因、分型、溯源。
人类:亲子鉴定、致病基因筛查、致癌基因筛查、血液筛查、肠道微生物组学研究。
动物:疾病筛查等。
物种鉴定: 名贵中药材。
三、核酸检测实验室建设
转基因检测流程——六个主要阶段
1. 样品验收:样品包装是否完好,要求独立包装,避免交叉污染, 核对标签, 核对检测项目。
2. 样品前处理:充分混匀样品,以避免样品的不均匀造成检测误差。样品研磨 注意不要产生溢洒,产生气溶胶,污染环境。
3.核酸提取
4. PCR反应
5. 结果判定
6 结果报告
一般要求:
设施和环境要求:1.有条件的实验室宜在所分割的各工作区域设置缓冲间,缓冲间的压力应为负压,与之相连的工作区域为正压
2.没有条件设置缓冲间的实验室,对检测区域进行功能划分后,根据不同的功能设定压力。 非检测人员不得进入实验区域
3. 不同功能的核酸检测区域应分隔成独立的实验室,并有标识牌,各功能区之间不能直通,各区域间如果紧密相连,应设传递窗;
4. 紫外灯的要求:每个工作区域顶部应安装紫外灯,波长为254nm,安装数量是每20平米,安装一只40W的紫外灯,灯与地面的距离不应超过2.0m±0.1m
工作顺序:所有试验操作应在规定的区域进行,待测样品的流动应遵照转基因产品检测工作流程的顺序,严格按照单一方向进行。
......
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