大肠杆菌DNA定性标准物质的制备及在枸杞子污染检测中的应用

摘 要：选取大肠杆菌毒力基因escV、stx2和hlyA为靶标序列构建质粒标准品，快速检测大肠杆菌。通过菌落聚合 酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）和测序对所构建的重组质粒进行验证，传15 代测序验证质粒稳定 性。制备escV、stx2、hlyA质粒标准品，对标准品进行检测限、均匀性、稳定性和定性实验。然后利用escV、stx2和 hlyA质粒标准品对枸杞子中大肠杆菌进行检测。通过菌落PCR和测序结果表明escV、stx2和hlyA标准品制备成功。 PCR体系对质粒标准品检测灵敏度达pg级别，并具有特异性，传15 代测序的结果表明质粒标准品具有稳定性。 escV、stx2和hlyA质粒标准品检测限分别为3.93×106 、2.41×105 拷贝/mL和2.14×105 拷贝/mL，在25、4、－20 ℃条 件下具有很好的稳定性和性质。escV、stx2和hlyA质粒标准品对34 批枸杞子样品检测，escV、stx2没有被检测出， 有3 批枸杞子样品中检测出hlyA（检出率为8.82%）。参考GB 4789.6—2016《食品微生物学检验 大肠菌群计数》方 法结合16S rRNA测序对这3 批枸杞子样品进行检测，结果没有检测出大肠杆菌，说明质粒标准品检测灵敏度高，相 较于传统微生物分离鉴定，检出率有了很大的提高。

关键词：枸杞子；大肠杆菌；质粒标准品；快速检测

枸杞子（Lycium barbarum L.）是茄科枸杞属植物的 干燥成熟果实[1]，具有抗氧化、控制血糖、养肝明目、 提高免疫力等多种功效[2-4]，是卫生部批准的药食两用食 物。枸杞子糖分含量很高，多糖是它主要的功能成分[5]， 占比约为3.36%[6]。所以枸杞子易泛油，一旦贮存不当很 容易腐烂、虫蛀甚至被微生物污染，目前，对枸杞子的 微生物污染情况研究不够深入[7]。

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是最为常见的食 源性微生物之一[8]。大肠杆菌中常见的毒力基因有志贺 样毒素基因（stx1和stx2）、紧密素（eae）、溶血素基 因（hly）、O抗原编码基因（rfb）、β-葡糖醛酸糖苷 酶基因（uid）和鞭毛抗原基因（fli）[9-12]。目前对于大 肠杆菌的检测从传统方法到包括常规聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction，PCR）、多重PCR、实时 PCR[13-14]的分子生物学技术、DNA微阵列技术[15]、免疫 检测技术[16]、传感器芯片技术[17]和质谱技术[18]。

这些方 法基于相应的核酸标准物质。由于质粒标准品具备稳定 性好、纯度高等优点[19-21]，常常用于临床应用检测阳性对 照品。由于缺少大肠埃希氏菌毒力基因监测相关质粒定 性标准样品[22]，参考物质溯源性不强、不确定度高、评 价模式单一等严重缺陷，导致各检测机构之间的检测结 果差异极大，无法为食品检验数据提供技术保障。 本研究针对目前相关领域急需，构建大肠杆菌毒力 基因质粒标准品，保证大肠杆菌关方法检测结果的可比 性，并以药食两用食物枸杞子为研究目标，快速检测大 肠杆菌污染情况，以期为食品中大肠杆菌的快速检测提 供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 

34 批枸杞子样品购于2018年1月，存放于河南大学 国家食用菌加工技术研发专业中心。大肠杆菌（O157、CMCC 43201、CICC 10372、 ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（CICC 23656）、阪 崎肠杆菌（CICC 21560）、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 14028）、单核细胞性李斯特菌（ATCC 19115）均由中 国食品药品检定研究院于2018年5月赠送，并贮存于河南 大学国家食用菌加工技术研发专业中心。

本研究中选择 CICC为基因组提供菌。 琼脂糖 东格生物技术有限公司；6×DNA loading Buffer、GoldView I型核酸染色剂、氨苄青霉素 美国 Solarbio公司；琼脂、麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝培 养基、营养肉汤、营养琼脂 北京奥博星生物技术有 限公司；D2000 DNA Marker、Marker III、感受态细胞 （DH-5a）、2×Pfu PCR Master Mix（KP201）、细菌基 因组DNA提取试剂盒（DP302）、普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（DP209）、pLB零背景快速克隆试剂盒、快