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双缩脲是两个分子脲（即尿素）经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
整个反应的过程如图一（双缩脲生成反应式）。
双缩脲在碱性溶液中能与极稀的硫酸铜溶液产生紫红的颜色反应, 这个呈色反应叫做双缩脲反应。呈色的原理是形成了紫红色的络合物，结构如下图二（紫红色络合物结构式）。
双缩脲试剂事实上是一个碱性的含铜试液，由 0.1 g/mL氢氧化钠或氢氧化钾、0.01 g/mL硫酸铜和酒石酸钾钠配制。
双缩脲试剂中真正起作用的是硫酸铜，氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环境，因此它可被其他碱（如氢氧化钠）所代替。
向试剂中加入碘化钾，会延长试剂的使用寿命。
酒石酸钾钠的作用是保护反应生成的络离子不被析出变为沉淀,从而使试剂失效。
从上述反应原理即可看出，双缩脲反应不只是双缩脲所特有的反应。凡是分子中含有两个或两个以上肽键（—CONH—）的物质都能发生这种颜色反应。因此，一切蛋白质，或除二肽外的肽都可以发生双缩脲反应。
换言之，双缩脲试剂不能和二肽发生反应，因为二肽只有一个肽键。
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