抑郁症是致使人类自杀自残的元凶,影响全球超过16%的人口,患者主要表现为情绪低落、快感缺失等主观性症状,但缺乏客观性诊断指标,且与其他精神疾病症状没有显著差别。抑郁症缺乏客观的生物标志,使得学者们呼吁从组学、神经影像、神经免疫炎性机制等方面研究抑郁及抗抑郁机制,寻找生物标志物。代谢组学自1998年第一次出现,由于改进的质谱法具有更高的灵敏度和代谢物覆盖率,在近十年中得到迅速发展。

实验室前期研究发现柴胡疏肝散具有抗抑郁促动力作用,继而探讨了柴胡疏肝散组成之一的枳壳促胃肠动力和抗抑郁的作用。辛弗林作为本次实验的研究对象,是枳壳中的成分之一,其分子式为C9H13NO2,分子质量为167.20。本实验运用GC??MS/MS代谢组学方法检测分析治疗前后CUMS大鼠血清代谢物的变化情况,结合探讨辛弗林治疗CUMS大鼠后的行为学变化,以期筛选可以帮助诊断抑郁症的生物标志物。

1材料和方法

1.1实验动物和分组

雄性6周龄SPF级Sprague??Dawley大鼠24只,体质量(200±20)g,购买于上海思捷实验动物有限公司,动物许可证号:SCXK(沪)2013??0006。大鼠适应性饲养7d后,按体质量随机分为3组(4只/笼,n=8):正常组、模型组、辛弗林组(20mg/kg),辛弗林剂量参考文献及预实验结果,开始造模。

1.2主要仪器与试剂

Trace1310/TSQ8000型气相色谱??质谱联用仪(美国Thermo公司),TG??5MS毛细管色谱柱(美国Thermo公司),CPA225D型电子天平(Sartorius公司),Allegra64R型离心机(美国BeckmanCoulter公司),Vortex??Genie2型涡旋振荡器(美国ScientificIndustries公司),RevcoUXF型超低温冰箱(美国Thermo公司),HWS26型水浴锅(上海一恒科技有限公司),SPD1010??230型离心浓缩仪(美国Thermo公司),KQ??500B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),MilliporeSynergy型超纯水系统(德国Merck公司),TopScanHR动物轨迹与行为分析系统(美国clever公司),DepressionScanRH动物绝望自动分析系统(美国clecer公司),10~1000μL微量注射器(美国Thermo公司),YAN310型动物断头器(上海玉研科技仪器有限公司)。辛弗林(纯度>98%,批号:MUST??14082611,成都曼思特生物科技有限公司)、1,2??13C??肉蔻酸(纯度99%,批号:SH2326V,Sigma公司)、BSTFA(含1%TMCS,批号:BCBN4326V,Sigma公司)、C8~C40烷烃标准溶液(批号:1408653V,Sigma公司)、吡啶(纯度>99.8%,批号:PE202178,Thermo公司)、甲氧胺(纯度98%,批号:BCBN2932V,Sigma公司)、甲醇和正己烷(纯度≥99%,德国Merck公司)、戊巴比妥钠(纯度>98%,批号:140806,南京中医药大学附属医院)。

1.3造模方法与给药干预

按照文献方法选用经典CUMS造模复制抑郁大鼠模型。SD大鼠在室温22~24℃、湿度55%~65%,白昼自7:00~19:00,昼夜节律各为12h的光照环境下适应饲养7d后。正常组大鼠正常饲养,不予刺激;为使大鼠无法适应造模间隔、种类、频率,模型组和辛弗林组每日随机给予1种刺激包括:潮湿垫料、夹尾5min、束缚4h、禁食24h、禁水24h、昼夜颠倒、4℃冷水游泳、45°倾斜笼具,造模期间每种刺激不超过5次。CUMS模型实验大鼠造模时间共6周,后2周造模同时给予辛弗林。辛弗林溶于0.9%生理盐水中配置成2mg/mL溶液,利用涡旋混匀器和超声机使药物混匀,4℃冰箱保存。大鼠灌胃前,药物经水浴锅中加热至室温。在CUMS实验造模前0.5h给药,在每天同一时间每只大鼠按照10mL/kg的容积灌胃。

1.4行为学测试与样品采集

1.4.1糖水偏好实验

参考文献方法,大鼠先进行含糖饮水适应训练,每笼大鼠先给2壶1%蔗糖水。适应1d后,将1壶1%蔗糖水换为1壶纯水,再适应1d。禁食24h后,实验开始:每笼给1壶1%蔗糖水称质量记为W1,1壶纯水称质量记为W2。1h后,取下每笼的水壶称质量记录蔗糖水和纯水的消耗量,并记录为W3、W4。糖水偏好率=(W1-W3)/(W1+W2-W3-W4)×100%。

1.4.2开场实验

在造模第42天将大鼠置于敞箱规格为50cm×50cm×40cm的开场实验箱中。实验时关闭实验室灯,仅由仪器灯照明,将大鼠放置于敞箱中央利用数据自动采集系统跟踪大鼠的行踪,持续记录5min,然后取出大鼠放回鼠笼饲养。2次记录之间须将箱底及四面内壁清理干净,并喷洒75%酒精去除大鼠的气味,减少干扰。实验结束后,分析大鼠的活动总路程、理毛次数。实验最后1d,将所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉,经腹主动脉采血,收集于EDTA抗凝管中。血样在室温下静置30min后,3000r/min离心15min,吸取上清,分装移至1mL洁净EP管,置-80℃保存,留待检测。