a-酮戊二酸（-KG）作为重要的二元羧酸，参与微生物体内的碳氮代谢，并在整个碳氮代谢过程中起着至关重要的作用；在食品、制药、化学以及动物饲料等行业具有广泛的应用。内酮酸（PA）又称2-氧代丙酸，是最重要的氧代羧酸之一份，参与细胞体内的能量代谢，并在其中扮演着极其重要角色。目前，化学合成法因生产成本高，环境污染严重等缺点逐渐被无污染的生物发酵法所取代。本实验室在2010年筛选出了一株以甘油为碳源并过量积累a-酮戊二酸的菌株（ Yarrowia lipolytica WSH Z06），利用此菌株生产α-酮戊二酸，产量高达39.2g/，但是丙酮酸的产量却高达16.8g四。为了能够减少丙酮酸的积累，同时又能够过量积累α-酮戊二酸，研究人员采取了代谢改造和过程优化等策略来达到这一目标，但是丙酮酸积累的问题依然存在。酮酸联产为整个实验提供了一个新的思路。

在前期工作中本研究室对于发酵优化联产酮酸已经达到很好的效果，c-酮戊二酸和丙酮酸的产量分别高达674g和39.1g/由于α-酮戊二酸和丙酮酸的化学性质和物理性质较为相似，一般常用的分离提取方法无法将两者进行有效的分离。Pa等对于反应萃取法的研究比较多，先后采用了不同的单一萃取剂（磷酸三丁酯叫，三辛胺叫，三丁胺吗）和混合萃取剂（磷酸三丁酯，三辛胺，季胺氯化物）来分离发酵液中的内酮酸但是大量的有机溶剂的使用以及复杂的操作程序也限制该方法在工业上的广泛应用。在2013年，占宏德等通过筛选多种不同类型的交换树脂发现， D301树脂为分离α-酮戊二酸的最佳吸附树脂，并且通过阶段洗脱的策略，使α-酮戊二酸的收率达到了93.2%叼。李斌水等采用氯化钙沉淀发酵液中的-酮戊二酸，但是发酵液中会出现大量游离的CI Cl对金属容器腐蚀性较强且成本高，在工业上大规模应用受到制约。王东阳等采用氢氧化钙来沉淀发酵液中的a-酮戊二酸，氢氧化钙和-酮戊二酸沉淀结合较少，收率较低。而本文中主要对比了3种不同钙盐（CaCl2，CaCO3和Ca（OH）2）对发酵液中酮酸的影响，最后建立一种有效分离发酵液的a-酮戊酸的钙盐沉淀方法。并对分离提取过程工艺进行了探索，希望能为酮酸的提取和纯化提供理论参考。

1材料与方法

1.1试剂与仪器

丙酮酸和∝-酮戊二酸标品，购于上海国药集团有限公司；浓硫酸、CaC2、CaCO3和Ca（OH）2等均为国产分析试剂。酮酸发酵液：由本实验室发酵所得（菌株：Yarrowia lipolytica WSH-Z06C3），含有4468g/L的a-酮戊二酸和3693gL的丙围酸。

恒温培养箱：上海医疗器械研究所产品；恒温摇床：上海精密仪器仪表有限公司产品；15L发酵罐：迪必尔生物工程有限公司产品；台式高速离心机：德国艾本德公司产品；pH计：瑞士梅特勒-托利多公司产品； Agilent1260高效液相色谱仪：美国安捷伦公司产品。

1.2实验方法

1.2.1发酵液的预处理根据Zhou的发酵方法η，利用解脂亚洛酵母WSH-Z06C3发酵生产酮酸，待发酵结束后，将酮酸发酵液在8000g的条件下离心20min，去除沉淀物，收集上清液。然后通过纳滤膜仪器除去上清液中的大分子物质相对分子质量（>500），如蛋白质、色素。备用。

1.2.2钙盐沉淀法分离α-酮戊二酸配制50g/L的α-酮戊二酸标准溶液，取50mLα-酮戊二酸水溶液，加入等摩尔质量的钙盐固体。待固体完全溶解后，用质量分数为50%的Ca（OH）2缓慢调节pH至3个梯度：6.0、6.5和7.0.沸水浴加热至上清液澄清（15min），抽滤，量取滤液体积，高相液相色谐法（HPLC）检测滤液中a-围戊二酸的含量。