丹参为唇形科鼠尾草属植物，其根入药，化学成分含脂溶性的二萜醌类和水溶性的酚酸类。丹参酮ⅡA磺酸钠（sodiumtanshinoneⅡAsulfonate，STS）是二萜醌类化合物丹参酮ⅡA经磺化而得到的水溶性磺酸盐。临床数据和药理学研究表明，由于其具有抗氧化活性、减少血栓形成、能够降低缺血再灌注所产生的心肌线粒体脂质体过氧化物的含量、改善心肌线粒体膜的流动性、促进旁系血管再生及有效增加冠状动脉流量，对冠心病心绞痛及胸闷、心肌梗死、室性早搏等有显著疗效，其注射剂已在临床上广泛使用。Wang等从STS原料中通过色谱分离纯化、LCMSn和NMR鉴定推测出8种有关物质；Zou等从STS原料中通过色谱分离纯化、UV、LC-MS和NMR鉴定推测出6种有关物质。而其磺化过程中的副产物和杂质成分研究还不够完善，且该类化合物结构复杂，化学全合成难度大；同时，在STS原料生产和储存过程中均存在产品不稳定的现象，如酸性增强、有效成分降解、含量降低等等。由于在质量标准中须监控其有关物质，因此，提供高纯度的有关物质对照品具有重要意义。

随着药品质量标准提高，ICH指导原则要求尽可能提供单杂大于0.1%的有关物质的结构和可能的产生机制、构效关系和药理毒理数据等。本研究通过制备液相技术分离纯化丹参酮ⅡA磺酸钠原料中有关物质的组分，并通过HPLC、MS和NMR分析鉴定出三种有关物质结构，分别确证为丹参酮ⅡB磺酸钠、丹参酮Ⅰ磺酸钠和紫丹参甲素磺酸钠。

1材料和方法

1.1仪器与材料

VarianSD-1液相制备及色谱装填系统，色谱柱L&L4001（2.54cm×25cm），色谱柱L&L4002（5.08cm×25cm）；色谱填料ODS-AQ（5mm，12nm）和色谱填料PLRP-S（10mm，10nm）均购自日本YMC公司；Waters2695/2489高效液相色谱仪（美国Waters公司）；色谱柱ExtendC18（4.6mm×150mm，5mm，美国Agilent公司）；400M核磁共振波谱仪（NMRAvanceⅢ400MHz，瑞士Bruker公司）；超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪（AcquitytimUPLC&Q-TOFMSPremier，美国Waters公司）。STS原料、纯化水（本公司自制）；甲醇和三乙胺（TEA）（色谱纯，美国Tedia公司）。

1.2方法

1.2.1STS样品处理取STS原料8.0g进行样品前处理，用纯化水配制成10mg/ml的STS溶液，在37℃条件下减压旋蒸结晶后经滤纸过滤除去析出的固体沉淀，滤液经过0.22mm有机相微孔滤膜过滤除菌，得到STS原料供试样品。取STS原料60.0g，甲醇3.8L，投入5L反应瓶中，搅拌加热，澄清后加入16g药用活性炭，控温65℃条件下加热至回流并保持此状态50min，抽滤后减压旋蒸结晶后滤纸过滤除去析出的固体沉淀，滤液经过0.22mm有机相微孔滤膜过滤除菌，得到STS精制液供试样品。

1.2.2有关物质的富集和一步纯化选用装填PLRP-S聚合物填料的VarianL&L4002色谱柱。上样体积800ml，流速为100ml/min，柱温为25℃，检测波长为271nm。流动相A为甲醇，流动相B为水，在0～8min以20%A+80%B洗脱，8～70min以20%A+80%B继续梯度洗脱至80%A+20%B。根据紫外检测结果实时收集STS有关物质富集样品。

1.2.3有关物质二步纯化及精制选用装填ODS-AQ硅胶填料的VarianL&L4001色谱柱。上样体积800ml，流速为25ml/min，柱温为25℃，检测波长为271nm。流动相A为含0.1%TEA的甲醇溶液，流动相B为含0.1%TEA的水溶液，在0～8min以20%A+80%B洗脱，8～30min以20%A+80%B继续梯度洗脱至40%A+60%B，根据紫外检测结果实时收集STS有关物质精制样品。

1.2.4有关物质HPLC法检测在有关物质富集、纯化及精制过程中采用HPLC方法对STS样品组成及含量进行全程检测。采用AgilentExtendC18柱（4.6mm×150mm，5mm），上样体积20ml，流速为1ml/min，柱温为25℃，检测波长为271nm。