1、安全要求

实验操作时穿工作服、戴口罩和手套；提取和净化操作都应在通风橱中进行，避免溶剂气体吸人和皮肤接触；废弃的化学试剂收集到专用容器中集中处理。

2、急救措施

皮肤接触到有机溶剂或酸、碱溶液后用清水清洗，有机溶剂或酸、碱溶液溅人眼中用清水灌洗。

3、适用范围

该标准操作规程适用于牛奶中吡利霉素残留量的确证检测。

4、职责

进行该项检验的检验员必须按该标准操作规程进行检验，质量监督员负责监督该标准操作规程的正确执行。

5、原理

试料中残留的毗利霉素用1％甲酸乙腈溶液提取，MCX固相萃取柱净化，氮气吹干浓缩，以高效液相色谱一串联质谱法测定，异吡利霉素作内标，内标法定量。

6、方法灵敏度

吡利霉素在牛奶中的检出限为2μg/kg，定量限为5μg/kg。

7、注意事项

在固相萃取预洗、淋洗和洗脱过程中应注意流速，不能过快或过慢。

8、材料、仪器、试剂的准备及基本要求除特别注明外，以下所用试剂均为分析纯；水为符合GB/T 6682规定的一级水。

8.1 对照品、试剂和药物储备液、工作液准备；

8.1.1 吡利霉素对照品 含C₁₇H₃₁ClN₂O₅S不得少于97.0％；

8.1.2 异吡利霉素对照品 含C₁₇H₃₁ClN₂O₅S不得少于94.0％；

8.1.3 甲酸；

8.1.4 乙腈 色谱纯；

8.1.5 正丙醇；

8.1.6 乙酸铵；

8.1.7 甲醇 色谱纯；

8.1.8 1％甲酸的50mmol／L乙酸铵溶液 取乙酸铵0.77g，置200mL量瓶中，加2mL甲酸，用水溶解稀释至刻度，摇匀即得。

8.1.9 1％甲酸乙腈溶液 量取1mL甲酸，置100mL量瓶中，用乙腈稀释并定容，摇匀即得。

8.1.10 2％甲酸水溶液 量取2mL甲酸，置100mL量瓶中，用超纯水稀释并定容，摇匀即得。

8.1.11 5％氨水甲醇溶液 量取5mL氨水，置100mL量瓶中，用甲醇稀释并定容，摇匀即得。

8.1.12 吡利霉素标准储备液(1mge／mL) 精密称定盐酸吡利霉素对照品约11.23mg，置10mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释成浓度为1mg/mL的标准储备液。-20％以下保存，有效期为3个月。

8.1.13 异吡利霉素内标储备液(1mg/mL) 精密称定盐酸异吡利霉素对照品约11.59mg，置10mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释成浓度为1mg/mL，-20℃以下保存，有效期为3个月。

8.1.14 标准工作液配制(1μg/mL) 准确量取0.1mL标准储备液，置于10mL量瓶中，用甲醇稀释并定容，即成10μg/mL吡利霉素标准工作液；从中量取1.0mL，置于10mL量瓶中，用甲醇稀释并定容，摇匀即得lμg/mL吡利霉素标准工作液。-20℃以下保存，有效期为1个月。

8.1.15 内标工作液配制(1μg/mL) 准确量取0.1mL内标储备液，置于10mL量瓶中，用甲醇稀释并定容，即成10μg/mL内标工作液；从中量取1.0mI。内标工作液，置于10mL量瓶中，用甲醇稀释并定容，摇匀即得1μg/mL的内标工作液。-20℃以下保存，有效期为1个月。

8.2 仪器和设备；

8.2.1 高效液相色谱-串联质谱仪(配电喷雾离子源)；

8.2.2 天平感量0.01g；

8.2.3 分析天平 感量0.00001g；

8.2.4 涡旋混合器；

8.2.5 离心机；

8.2.6 旋转蒸发仪；

8.2.7 氮吹仪；

8.2.8 离心管50mI。

8.2.9 微孔滤头0.45μm；

8.2.10 鸡心瓶，50mL；

8.2.1l 固相萃取装置；

8.2.12 MCX固相萃取柱(60mg/3mL)，或相当者。

9、检验步骤

9.1 试料的制备；

9.1.1 取新鲜或解冻的供试样品，作为供试试料。

9.1.2 取新鲜或解冻的空白样品(2±0.02)g，作为空白试料。

9.1.3 取新鲜或解冻的空白样品(2±0.02)g，添加1斗∥mL标准工作液0.2mL，作为空白添加试样(阳性对照)。

9.2提取

9.2.1 取试料(2±0.02)g，置50m1．离心管，加入内标工作液0.2mL，再加入1％甲酸乙腈溶液5mL，涡旋混合提取10s，5000r/min离心5min，转移上清液至50mL鸡心瓶。

9.2.2 离心管中的沉淀物用l％甲酸乙腈溶液5mL重复提取1次，合并上清液，加正丙醇3mL，于50℃真空旋转蒸发至干。

9.2.3 残余物用含1％甲酸的50mmol/L乙酸铵溶液5mL溶解，备用。

9.3 净化

9.3.1 MCX小柱依次用甲醇、水各3mL预洗。

9.3.2 取全部备用液过柱。

9.3.3 用2％甲酸水溶液、甲醇各3mL淋洗，减压抽干。

9.3.4 用5％氨水甲醇溶液3mL洗脱，抽干，洗脱液全部回收。

9.3.5 洗脱液于60％氮气下吹干。残余物用1.0mL甲醇溶解，摇匀，经微孔滤头过滤后，供高效液相色谱一串联质谱仪测定。

9.4 测定

9.4.1 色谱条件；

9.4.1.1 色谱柱：XBridge C₁₈150mm×2.1mm(i.d.)，粒径5μm，或相当者；

9.4.1.2 流动相：乙腈+0.0lmol/L乙酸铵(30+70，v/v)；

9.4.1.3 流速：0.2mL／min；

9.4.1.4 柱温：30℃；

9.4.1.5 进样量：10μL。

9.4.2 质谱条件

9.4.2.1 离子源参考参数，电喷雾离子源(ESI⁺)，毛细管电压为3.4 kV，锥孔电压为34 V，萃取电压为3 V，RF透镜电压为lV；源温为105℃，脱溶剂温度为350℃；锥孔气流速为50 L／h，雾化气流速为450L／h。

9.4.2.2质量分析器参考参数见表。

9.4.2.3光电倍增器电压：650V。

9.4.2.4定性、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量见表。

参考资料：兽药残留检测标准操作规程，版权归原作者所有，如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系。

相关链接：试剂，吡利霉素，异吡利霉素，乙酸铵