固定液黏度不宜太高。低黏度的固定液扩散系数大，反应速度快，色谱柱效能高。同时还要选用对紫外光不敏感的化合物。常用反相液液分配色谱法的固定液有C₁₈、C₈、苯己基、五氟苯基等；正相的有NH₂基、CN基。反相键合固定相多为硅烷化键合，有单键、三键之分。

液液分配色谱法现已广泛采用化学键合固定相。它是借助于化学反应合成方法将有机分子以共价键形式，通常为单分子层连接在载体上。化学键合固定相突出的优点是耐流动相冲洗，热稳定性好，在很大程度上减弱了固定相表面的活性位点。现代高效液相色谱法主要使用3类填料制作色谱柱，一是超纯硅胶载体色谱柱，属于高密度键合相，分析对象广泛；二是亲水性化合物专用色谱柱，属于硅胶低密度键合相，适于分离强极性化合物；三是杂化颗粒色谱柱，耐高压，pH 1～12，不仅用于高效液相色谱(HPLC)，更适于超高效液相色谱(UPLC)。在反相高效液相色谱法中，农药残留分析广泛使用的固定相是C₁₈。C₈也是常用的一种，它更适于分析极性强一些的农药品种，如磺酰脲类除草剂。

手性同定相(chiral stationary phase，CSP)仍然是今后液相色谱法固定相的研究方向，因为约25％的农药品种具有手性对映体，加之手性对映体的活性、降解代谢和残留特点存在着差异。目前商品化的手性色谱柱还难以满足要求，手性固定相有配体交换型固定相、环糊精型手性固定相、高聚物手性固定相、蛋白质手性亲和固定相等。

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