2.4　菌龄对原生质体产量与再生率的影响

试验结果如图3，当菌龄低于4天，随着菌龄的增加，原生质体的产量也会增加，当菌龄高于4天时，随着菌龄的增加，原生质体的再生率逐步降低；当菌龄大于6天时，原生质体再生率急速下降。经过回归方程计算可以得出：原生质体再生率在5.4天时达到最高，约为2.07%；原生质体的产量在4.1天时达到顶点，为2.01×108个/毫升。

2.5　稳渗剂种类对原生质体制备产量与再生率的影响

图4可以看出，当选取甘露醇作为渗稳剂时，原生质体的产量最高但是再生率很低，当使用硫酸镁作为稳渗剂时，原生质体的产量排名第三，仅处于甘露醇和葡萄糖作为渗稳剂之后；硫酸镁的再生率为1.73%，葡萄糖的再生率为1.60%，此再生率仅次于用蔗糖当作稳渗剂的再生平板，蔗糖的再生率为1.94%。由于在制备原生质体时，使用硫酸镁当作稳渗剂，不但能够较好的维持菌丝体细胞膜内外渗透压的稳定性，同时渗稳剂中的Mg2+也能够通过交联羧基和磷脂质实现维持细胞膜稳定的作用。但是Mg2+的供能能力较差，难以维持细胞壁再生所需要的能量，同理单糖也无法实现此项需求。因此，想要实现原生质体再生率最大化，应该选用硫酸镁作为制备渗稳剂，蔗糖作为再生渗稳剂。

2.6　稳渗剂浓度对原生质体产量与再生率的影响

图5可以看出，渗稳剂浓度对于原生质体的产量和再生率都能产生影响，当使用纯净水作为参照时，目标菌丝的原生质体产量是4.2×107个/毫升，原生质体的再生率为0。在此基础上不断加大渗稳剂的浓度，可以看出原生质体的产量和再生率均呈现先增大后减小的变化。通过观察试验曲线可以发现，当渗稳剂浓度低于0.2摩尔/升时，随着度增加，原生质体再生率提升明显，此后随着浓度增加原生质体再生率无明显变化；经过回归方程计算：当渗稳剂浓度为0.51摩尔/升时，原生质体产量达到最高1.85×108个/毫升，当稳渗剂的浓度为0.33摩尔/升的时候，原生质体的再生率会达到最大值1.97%。

2.7 pH对原生质体产量与再生率的影响

通过观察下图6，可以发现当渗稳剂pH处于3～4时，原生质体的产量基本上是稳定没有变化，原生质体的再生率为0；当处于4～5时，对于原生质体的产量和再生率都有显著的提升刺激；当处于5～7时，原生质体的产量与再生率都会出现不同程度的下降，回归分析后得出，当pH为5.10时，原生质体的产量可达到最大值，为2.34×108个/毫升，当pH为5.69时，原生质体的再生率可达到最大值，为1.86%。

3 小结与讨论

供给试验使用的几种因素在固定限度之中时，都能够提升原生质体的产量以及再生率，并且具有明显的效果。原生质体的最佳制备条件为，在pH为5.0的条件下，使用0.5摩尔/升硫酸镁作为稳渗剂，在温度达到28℃的时候对5日龄菌丝进行酶解3小时。最佳再生条件为，在pH为5.5的条件下，使用0.5摩尔/升蔗糖作为稳渗剂，在温度达到27.8℃的时候对6.5日龄菌丝进行酶解2.9小时。

酶活和酶解的反应时间将会决定原生质体的产量大小，各种因素对原生质体的产量所造成的影响效果由小到大依次为，渗稳剂、龄、菌酶解时间、酶解温度。同时，酶活性受到酶解液pH和酶解温度的影响，进而影响原生质体产量。当pH为4.5～6.0范围内，则45～55℃为纤维素酶的最适宜温度，30～37℃为蜗牛酶的最适宜温度，酶促反应的快慢与酶活性成正相关关系；同时混合酶的酶解效果要比单一酶效果显著；在单位时间内，混合酶产生的原生质体的数量要大于单一酶所产生的原生质体的数量。

原生质体活性的大小可直接决定原生质体再生率的大小，本次研究中选取的各项因素对于原生质体再生率影响效果由小到大分别是，酶解温度、菌龄、酶解时间、渗稳剂浓度。渗稳剂的浓度过大会导致原生质体失水失活、渗稳剂浓度过小会导致原生质体胀破，这都会影响原生质体的再生率。当反应酶处于其适宜反应条件时，酶解的反应比较快速，因为混合酶系能够对各种各样的底物进行酶解反应，但是，随着酶解时间不断增加，原生质体膜暴露时间过长会导致其细胞壁再生下降。因此，原生再生率也将会减弱。温度为（25±1）℃时，是香菇菌丝和原生质体的最佳生长温度，过高或者过低均会影响再生率。

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