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响应面法优化超声辅助提取桦剥管菌多糖及其抗氧化活性研究(一)

发布时间:2021-02-22 16:19 作者:周世红

桦剥管菌隶属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、剥管菌属,又称为桦多孔菌、桦滴孔菌或桦孔菌,是桦木属树木专有性木腐菌。其形态特征:子实体中大型(最大直径可达30cm),无柄或几乎无柄,上部为扁半球形,下部为扁平形,生长初期为污白褐色,后期为褐色。表面有一层褐色的薄薄的表皮,撕去后可露出白色的菌肉,边缘内卷(图1,照片由延边华夏桑黄菌业有限公司提供)。菌肉很厚实,近肉质且口感滑嫩,经过晾晒脱水后,菌肉会成为较轻的革质状。桦剥管菌分布地区广泛,陕西、福建、安徽、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、甘肃、四川、云南、贵州、新疆、西藏、河南、湖南等地区。

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桦剥管菌既是能够高效地降解木质纤维素的褐腐菌,也是一种实用真菌与药用真菌。桦剥管菌多糖是桦剥管菌的主要活性成分之一,具有消炎、抑菌的功能,同时,桦剥管菌多糖具有“二抗作用”,即抗病毒和抗癌作用。目前,国内外对桦剥管菌的降解木材能力以及提取物的研究较多,而有关研究和应用桦剥管菌多糖的报道较少,桦剥管菌为一年生真菌,产量高且在我国储量丰富,本研究以桦剥管菌子实体干品为实验材料,采用响应面法优化桦剥管菌多糖超声辅助提取工艺,通过单因素实验和Box-Behnken(BBS)实验,确定桦剥管菌多糖最佳提取工艺条件,并对其进行抗氧化活性研究,以期为桦剥管菌的开发、研究与利用提供科学的理论依据。

一、材料与方法

1、材料与试剂

桦剥管菌子实体干品,2017年11月购于延边华夏桑黄菌业有限公司。

葡萄糖、苯酚、浓硫酸、硫酸亚铁水杨酸、H202、抗坏血酸(VC)、1-1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、95%乙醇,以上试剂均为分子纯。

2、仪器与设备

实验所用仪器、设备如表1所示。

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3、方法

(1)桦剥管菌多糖的提取工艺流程

桦剥管茵子实体干品→烘干至恒质量→桦剥管茵粉→取19桦剥管茵粉加水调配液料比→水浴提取→超声波处理→离心→稀释100倍→苯酚→硫酸法显色→490nm测定吸光值。

(2)葡萄糖标准曲线的绘制

精密称取105℃、4h烘干至恒重的葡萄糖50mg定容于500mL容量瓶中,配成0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别精密移取葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、lmL于大试管中,补加蒸馏水至1.0mL。分别精密移取上述葡萄糖溶液1mL,分别加6%苯酚溶液0.5mL,浓硫酸2.5mL,震荡摇匀,室温放置10min后于490nm测定吸光值。

(3)桦剥管菌多糖含量及得率的测定

采用苯酚-硫酸法进行桦剥管菌多糖含量的测定。准确吸取样品溶液lmL于试管中,分别加6%苯酚溶液0.5mL,浓硫酸2.5mL,震荡摇匀,室温放置10min后于490nm测定吸光值。根据测得的吸光值带入标准曲线回归方程,计算得桦剥管菌多糖浓度。再将多糖浓度带入以下公式,计算桦剥管菌多糖得率:

桦剥管菌子实体多糖得率(%)=C×V×n/m×100%,其中,C是测得吸光度对应的浓度;V是提取液总体积;n是稀释的倍数;m是桦剥管菌子实体粉末质量。

(4)桦剥管菌多糖提取单因素实验

按工艺流程方法提取桦剥管菌多糖,选择水浴温度、超声温度、超声时间、超声功率、液料比进行单因素实验,以桦剥管菌多糖得率为研究指标,考察各个因素对桦剥管菌多糖得率的影响。不同因素梯度条件见表2。


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(5)超声波辅提桦剥管菌多糖工艺的Box-Behnken响应面实验设计

基于单因素实验结果,选择水浴温度(A)、超声功率(B)、料液比(C)为自变量,桦剥管菌多糖得率(Y)为响应值,应用Design—Expert.V8.0.6软件的Box-Behnken(BBD)实验原理设计3因素3水平响应面实验,对超声波辅提桦剥管菌多糖的工艺条件进行优化。实验因素及水平设计表,见表3。

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(6)羟基自由基清除力测定

根据H2O2与Fe2+作用产生羟基自由基,并使水杨酸显色的方法测定羟基自由基清除能力。参照林琳的实验方法并做适当修改。分别精确配制0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、4.0mg/mL、8mg/mL样品多糖溶液,依次在试管中加入1.0mL的FeSO。溶液(9mmol/L),1.0mL的不同浓度的桦剥管菌多糖溶液,1.0mL的H202溶液(0.03%)和1.0mL的水杨酸溶液(9mmol/L)。将反应液置于37℃水浴30min,在510nm处测定各反应液的吸光值。空白组的多糖溶液由蒸馏水代替。对照组用同等浓度的VC溶液代替多糖溶液。按照下式计算羟基自由基的清除率。

羟基自由基清除率(%)=(Ao-A)/Ao×100%,其中,Ao:空白组的吸光值;A:样品组的吸光值。

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相关链接:二苯基-2-苦肼基硫酸亚铁水杨酸苯酚

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