构建重组质粒是现代分子生物学中十分重要的技术。传统的质粒构建多采用限制性核酸内切酶和DNA连接酶的方式，但这种方法常依赖酶切位点，酶切耗时较长还可能会引入一段不需要的序列，另外限制性核酸内切酶的价格也较为昂贵。近几年以来，无缝克隆的方法发展迅猛，相比较传统方法，无缝克隆的方法不受酶切位点限制而且操作简便快速。

目前市场上无缝克隆试剂盒种类繁多，如NEB公司的NEBuilder试剂盒、Thermo公司的GeneArt试剂盒、CloneTech公司的In-Fusion试剂盒等。其采用的无缝克隆技术和原理各有不同，共同的特点是成本相对较高，每次反应大约需要18-36美元。Zhang等所建立的SLiCE（Seamlessligationcloningextract）方法是一种利用大肠杆菌细胞内同源重组相关酶进行DNA克隆的新方法，其机理在于不依赖于RecA-的片段重组。Motohashi从成本角度进一步优化了SLiCE技术，选用RecA-实验菌株E.coliJM109提取细胞裂解液，并优化了裂解液配方降低了裂解成本，使基于SLiCE技术的反应折合人民币仅仅0.4元一次。相比较于市面上的无缝克隆技术，SLiCE技术为目前最便宜的无缝克隆技术。

虽然SLiCE反应能实现较为经济的无缝克隆，但是SLiCE反应产物的转化依赖于高转化效率的感受态细胞，例如Zhang等采用1×1010CFU/μg电转化效率的感受态细胞和1×109CFU/μg的化学转化效率的感受态细胞，Motohashi则采用的是1×108CFU/μg化学转化效率的感受态细胞。商业化的高感受态细胞价格不菲，但自制高感受态细胞工序较为繁琐，且转化效率往往不稳定，因此很多无缝克隆方法建立时都考虑到了感受态细胞效率这个因素。

对于无缝克隆的高感受态细胞依赖问题，Zhang等将λ噬菌体Red/ET重组系统导入到DH108菌株用于SLiCE反应，通过提高克隆子形成率从而提高克隆效率，由于菌株不易获得使得该方法推广到各个实验室有一定困难；王广珺等在使用T4聚合酶进行无缝克隆的基础上，通过添加退火缓冲液进行退火处理，将重组效率提高了10倍之多。据最新报道体内细胞进行核酸片段重组是基于核酸外切酶，对于采用细胞裂解液进行无缝克隆的SLiCE而言，我们推测采用退火处理的方式也有可能提高SLiCE的重组效率。此外，电转化法很容易获得很高的转化效率，但此前无缝克隆采用电转化鲜有成功的例子，我们推测很可能与无缝克隆反应带来杂质有关，如SLiCE反应就有反应缓冲液，因此本文对SLiCE反应产物进行了纯化后再实施电转化，以期待获得更高的克隆效率。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和质粒本研究采用的菌株大肠杆菌（Escherichiacoli）JM109、DH5α、MG1655以及质粒pUC19等均为实验室保存。

1.1.2培养基LB培养基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl；2×YT培养基：1.6%胰蛋白胨，1%酵母提取物，0.5%NaCl；SOC培养基：2%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，10mmol/LNaCl，2.5mmol/LKCl，10mmol/LMgCl2，10mmol/LMgSO4，20mmol/L葡萄糖。

1.1.3酶和试剂高保真酶：PrimeSTARMaxDNAPoLymerase，大连TaKaRa产品；Taq聚合酶：2×TaqMasterMix（DyePlus），南京Vazyme产品；限制性核酸内切酶：EcoRI和BamHI，大连TaKaRa产品；裂解缓冲液：3%（W/V）TritonX-100，50mmol/LTris-HCl（pH8.0）；SLiCEbuffer（10×）：500mmol/LTris-HCl，pH7.5，100mmol/LMgCl2，10mmol/LATP，10mmol/L二硫苏糖醇，用0.22μm滤膜过滤，以40μL体积分装到PCR管中，放置-20℃保存；10×退火缓冲液：0.1mol/LTris-HCl，pH8.0，1mol/LNaCl，10mmol/LEDTA；硅藻土悬浊液：称取1g硅藻土（Celite545，Fluka），用5mL蒸馏水悬浮并轻轻倒入已装有45mL蒸馏水的Falcone管中，4min后回收悬浊液，再经1300×g离心1min，弃上清液。离心所得的颗粒用1mL蒸馏水悬浮，经高压灭菌后4℃保存备用。

1.1.4仪器与设备MyCyclerPCR仪，美国BioRad公司产品；DYY-6C型电泳仪，北京是六一仪器厂产品；凝胶成像仪、金属浴恒温仪，美国MajorScience公司产品；Centrifuge5417R、Centrifuge5804R离心机，美国Eppendorf公司产品。

1.2方法

1.2.1插入DNA片段和线性化载体DNA的制备有两种方式都可将质粒变成线性化载体，其具体做法如下：

1.2.1.1双酶切法制备线性化载体以来源于E.coliMG1655的可溶性吡啶核苷酸转氢酶（SolublePyridineNucleotideTranshydrogenase，udhA）的基因片段udhA（1401bp）作为插入基因，pUC19质粒作为线性化载体的模板。插入DNA片段采用表1的udhA-F和udhA-R引物进行扩增，采用限制性内切酶EcoRI和BamHI对pUC19质粒进行切割以获得双酶切线性化载体。随后DNA片段都经过乙醇沉淀和胶回收试剂盒（OMEGA）纯化。