橙皮苷是黄酮类化合物,主要来源于贲香科柑橘属植物。具有调节心血管系统、抗菌消炎、抗氧化、美白及机衰老等多种功能。橙皮苷是由两个单糖和一个更细个选按败其中的糖苷键，降低了橙皮育的浴解性。使共难溶于水,散溶于甲醇,且几乎不溶于苯、丙桐和氯仿等有机溶剂,难以被人体吸收利用。橙皮苷脱掉一个鼠李糖后得到的产物为橙皮素单葡萄糖苷,它具有与橙皮苷相以的化学结构功能,但与橙皮苷相比,橙皮素单匍萄糖具有更的溶解性,生物利用率更高。目前由橙皮苷制备橙皮素单葡萄糖苷主要有化学水解和生物酶解两种方法。化学法水解橙皮得到橙皮素单萄糖苷难以控制反应条件,产率低且易造成环境污染,无法进行大规模生产。生物酶解法是利用α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)水解橙皮苷上的鼠李糖糖苷,得到橙皮素单葡萄糖苷，相比于化学法,生物法反应条件温和，且无污染，具有良好的应用前景。α-L-鼠李糖苷酶在食品工业中,可用于柑橘类果汁脱苦,增强葡萄酒和饮料的香气，在医药工业中，可用于改善药物特性。

动物、植物组织和微生物都可以产生α-L-鼠李糖苷酶，其中，微生物产α-L-鼠李糖苷酶生产成本较低，且不受季节限制，应用广泛。海洋环境独特多样，蕴含多种可分泌不同催化特性酶类的微生物，成为新颖酶类开发的主要源泉。本研究从海洋样品中筛选产α-L-鼠李糖苷酶的细菌，并对菌株的酶学性质进行研究，为新颖α-L一鼠李糖苷酶的开发及应用奠定实验基础。

1.材料与方法

1.1样品来源

连云港市连云区海州湾高公岛海域海泥样品，置于冰盒，尽快带回进行试验。

1.2主要设备及药品

SW-CJ-1D单人超净工作台：苏州净化设备有限公司；CR22G高速离心机：株式会社日立制作所；IMark酶标仪：伯乐生命医学产品有限公司；LS50SⅡ立式高压蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司；90i全电动显微镜：株式会社尼康等。
柚皮苷、₂KHPO₄·3H₂O、MgSO₄·7H₂О等生化试剂均为分析纯：国药集团试剂公司；裂解缓冲液：TaKaRa；引物合成：南京思普金生物公司。

1.3培养基

富集培养基：1.0g橙皮苷，0.2gNaNO₃,0.1gK₂HPO₄·3H₂O，0.05gKCl，0.05gMgSO₄·7H₂0，0.02gFeSO₄·H₂O，溶于100mL陈海水。

发酵培养基：0.75g蔗糖，0.25g橙皮苷，0.25gNaNO₃，0.05gK₂HPO₄·3H₂O，0.025gKC1，0.025gMgSO₄·7H₂0，0.001gFesO₄·7H₂O，溶于50mL陈海水。

1.4实验方法

1.4.1产α-L-鼠李糖苷酶海洋细菌的筛选

准确称取2.5g高公岛海域泥土样品，加入到100mL灭菌的富集培养基，30℃，200r/min振荡培养48h。取6支试管，各加入9mL陈海水，高压灭菌后冷却。移液枪吸取1mL富集培养基加入1号试管，充分振荡混匀后从1号试管吸取1mL溶液加入2号试管，依次10倍浓度梯度稀释。分别吸取50uL稀释液，均匀涂布于筛选培养基平板，30℃倒置培养7d，观察是否出现透明圈。挑取产生透明圈的菌落在LB培养基上分离纯化。从纯化后的培养基上挑取单菌落点样至筛选培养基，30℃培养，若单菌落周围出现透明圈，则认为该菌能产α-L-鼠李糖苷酶。

1.4.2菌株DTCO3的鉴定

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对菌株DTCO3进行形态学观察和生理生化鉴定。

1.4.3菌株DTCO3的16SrDNA扩增及分析

用灭菌的牙签蘸取菌株DTC03，加入至20uL裂解液。80℃水浴锅静置15min后即为PCR模板。所采用的引物分别为27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'PCR。体系为：3.5μLddH2O，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，0.5μL模板，5μLpremix。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，进行32个循环；72℃终延伸10min。

PCR扩增产物送至南京思普金公司测序，所得序列提交GenBank。将该序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，用MEGA7.0软件进行16SrDNA序列的比对分析，并构建系统发育树。

1.4.4α-L-鼠李糖苷酶酶活力的测定

离心管中分别加入170μLpH6.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液和20μL10mmol/L的对硝基苯基-μ鼠李糖苷(pNPR)，45℃预热15min后加入10μL酶液，反应20min后，立即加入50μL2mol/LNa₂CO₃终止反应。反应体系中的酶液沸水浴灭活15min作为对照。8000r/min离心10min，测定上清液的A₄₀₅。

Α-L-鼠李糖苷酶酶活力单位(U)的定义：在最适反应条件下，每分钟内催化1μg底物(pNPR)转化为产物所需要的酶量，即为一个酶活力单位。

1.4.5菌株DTCO3α-L-鼠李糖苷酶酶学性质研究

α-L-鼠李糖苷酶的最适温度及热稳定性：试管中各加入170μLpH6.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液和20μL10mmol/LpNPR，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下预热15min后加入10μL酶液,反应20mim后，测定酶活,最高酶活性设为100%。酶液分别20℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃条件下保温1h后测定其酶活力，最高酶活性设为100%，探究温度对其稳定性的影响。

α-L-鼠李糖苷酶的最适pH及稳定性：配制pH4.0～9.0的缓冲液，测定酶液在不同pH条件下的酶活力。室温下，用pH4.0～9.0的缓冲溶液分别孵育酶液12h后，测定其剩余酶活力，并以未用缓冲液处理过的酶为对照，对照组酶活定义为100%。所用的缓冲液体系为醋酸–醋酸钠(pH4.0～6.0)、磷酸–磷酸钠缓冲液(pH6.0～8.0)、Tris-HCl缓冲液(pH8.0～10.0)。

金属离子对α-L-鼠李糖苷酶活性的影响：在最适反应条件下，在反应体系中添加终浓度为2mM的金属离子溶液(金属离子包括Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Mg²⁺、Mn²+、Ni²⁺、Ba²⁺、Al³⁺和Co²⁺)。以不添加金属离子的酶活为100%。

1.5数据处理与分析

每组试验设3组平行，重复试验3次，试验结果用平均值土标准方差(n=3)表示，采用Origin9.0作图。
 

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