2.3 总氮配方中添加磷酸甜菜碱对赖氨酸发酵的影响

以发酵运行中总氮起始添加时间(A)、磷酸甜菜碱在总氮中添加质量浓度(B)、糖与氮的体积比(C)为3个考查因素，以赖氨酸转化率为因变量，采用SPSS软件设计三因素五水平正交实验，实验结果如表5所示，SPSS软件对实验结果表5进行分析，其结果如表6所示。

从表6中可以看出：该模型p=0.001<0.01，说明模型极显著，R²=0.886，R²越接近1，说明模型拟合度良好，方程的显著性及可靠性极高。Ⅲ平方和比较B>A>C，说明3个因素对转化率影响大小依次为B，A，C。总氮中磷酸甜菜碱添加质量浓度(B)对赖氨酸糖酸转化率影响极其显著(F=12.934，p=0<0.01)；起始流加时间(A)对赖氨酸糖酸转化率影响极其显著(F=7.94，p=0.002<0.01)；糖氮体积比(C)对赖氨酸糖酸转化率影响最小，不显著(F=2.445，p=0.103>0.05)。

采用SPSS软件对表5实验数据方差分析，得出主因素A，B对赖氨酸转化率影响的95%置信区间，其结果如表7，8所示。

由表7得出：总氮中磷酸甜菜碱添加质量浓度(B)为8 g/L时糖酸转化率达到最高水平，置信区间最高(71.253%～71.319%)，为最佳添加质量浓度；质量浓度低于4 g/L或高于12 g/L时糖酸转化水平明显下降。由表8得出：总氮起始流加时间(A)为5～7 h时，赖氨酸的糖酸转化水平达到最高，置信区间最高(71.239%～71.305%)，当9 h开始流加后，糖酸转化率下降明显。

3 讨 论

三级种子活力、发酵罐OD峰值都影响着发酵罐指标，通过以往生产数据分析：当三级种子成熟周期大于9 h时，发酵罐OD峰值提前、耗糖速率下降，单产及转化率等生产指标下降明显，对生产极为不利。分析原因在于三级种子培养后期菌体密度增大，而通风、搅拌功率和罐压都提高到了极限，造成种子长期缺氧，在逆生长环境下用于生产的基因工程菌为了适应生存，菌体内过表达的产酸促进基因片段会大量丢失，造成菌体增殖活性增加而产酸能力下降，最终导致发酵指标显著下降。添加一定量磷酸甜菜碱起到了以下3个重要作用：

1) 维持和调节细胞渗透压。当外界渗透压发生剧烈变化时，细胞吸收或合成的甜菜碱通过稳定蛋白质结构、提高钾钠泵功能、阻止胞内水分丢失等方式增加细胞对渗透压的抗性。

2) 参与甲基化反应。甲基参与DNA甲基化反应，生产菌的遗传物质DNA经过甲基化修饰，其遗传及表达稳定性提高，有利于赖氨酸发酵过程中菌体产酸能力的保持。而甜菜碱分子中含有3个甲基，DNA甲基化修饰提供了甲基供体。在甲基化反应中，甜菜碱-高半胱氨酸甲基转移酶能够催化甜菜碱向高半胱氨酸转移一个甲基，分别生成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸，后者为VB12的合成提供甲基。而甲硫氨酸、VB12都有利于赖氨酸生产菌生长繁殖。

3) 磷酸甜菜碱中的磷酸根离子提高培养基中的溶磷，溶磷是限制菌体生长的主要因素，它参与菌体细胞壁、细胞膜构成，同时磷参与葡萄糖磷酸化分解以及ATP，AMP和AGP等能量物质的转化。因此磷酸甜菜碱替代氯化胆碱后，三级种子成熟周期、发酵罐OD峰值周期都明显缩短。

三级种子及发酵罐底料中添加磷酸甜菜碱后将三级种子成熟周期缩短1.5 h， 发酵罐OD由对照组均值0.727提高到0.875，发酵产酸较对照组提高10 g/L，转化率也有一定提升但不显著。原因分析有两点：

1) 在于赖氨酸发酵过程有中间放料，随着中间放料菌体及底料营养大量流失，造成OD峰值回降迅速，最终影响产酸及转化率。工业化生产上通过在赖氨酸发酵过程中流加总氮的方式补充营养，维持菌体中后期活性。

2) 菌体内合成的赖氨酸需要通过细胞膜赖氨酸外排泵排出胞外，在发酵中后期发酵液中赖氨酸质量浓度高与胞内质量浓度，造成细胞渗透压增高。通过总氮添加一定量的磷酸甜菜碱，当发酵中后期外界渗透压发生剧烈变化时，细胞吸收的甜菜碱发挥其维持和调节细胞渗透压的特性，能够通过稳定蛋白质结构、提高钾钠泵功能、阻止胞内水分丢失等方式增加细胞对渗透压的抗性。从而降低了发酵中后期破胞、提高了赖氨酸发酵转换率。

4 结 论

现常用的发酵促进剂有氯化胆碱、甜菜碱盐酸盐和蛋氨酸等，其中前两者含有大量氯离子不能被菌体利用，导致大量氯离子残存于发酵液中，对发酵罐及后提取设备造成很大腐蚀，严重影响设备使用寿命，而且经常引起设备微漏造成发酵罐染菌。磷酸甜菜碱作为新型发酵促进剂，其中的磷酸根离子可以直接被菌体利用，甜菜碱可以参加甲基化代谢和调节细胞渗透压，减少细胞破碎。研究表明：磷酸甜菜碱替代等量氯化胆碱，可显著提高三级种子生长速率、缩短成熟周期。赖氨酸发酵OD值、放罐酸与底料中磷酸甜菜碱添加量成正相关，发酵配方中磷酸甜菜碱添加量为添加0.5 g/L时转化率、产酸达到最优。总氮中磷酸甜菜碱最佳使用条件为：质量浓度为8 g/L、添加时间为发酵罐运行5～7 h、糖氮体积比控制在20～28。研究结果对降低赖氨酸生产成本、降低氯离子对设备腐蚀有指导意义。

声明：本文所用图片、文字来源《分析仪器》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系删除

相关链接：蛋氨酸，赖氨酸，氯离子