β-甘露聚糖酶是一类能够水解以β-1，4-D-吡喃甘露糖为主链的内切水解酶的总称，属于半纤维素酶类，广泛存在于自然界。微生物是工业生产甘露聚糖酶的主要来源，真菌和细菌都是产生甘露聚糖酶的主要微生物，其中细菌是产β-甘露聚糖酶的最大群体。甘露聚糖酶有广泛的应用价值，在食品加工、造纸、畜牧业、石油开采及其它领域都有光明的应用前景。近年来，随着我国畜牧养殖业的快速发展，甘露聚糖酶作为第三代饲料酶成为了研究的热点。

在饲料中添加β-甘露聚糖酶可促进营养物质的消化吸收，降低动物的营养代谢和营养消耗，提高饲料转化率；改善肠道微生态环境，增强动物免疫力；促进生长激素的分泌，加快生长速度；提升低质量饲料的营养价值等。然而一般β-甘露聚糖酶的耐酸性较差，难以在动物肠胃环境下发挥作用，因此寻找具有耐酸性的β-甘露聚糖酶是关键所在。

本实验以耐酸性作为筛选指标，从魔芋种植土壤中筛选得到耐酸性的β-甘露聚糖酶的产生菌，对该菌的发酵条件进行初步优化，为后续研究提供基础。

一、材料和方法

1、材料

（1）样品来源

土壤样品采集自重庆市奉节县黄国军魔芋种植场。

（2）培养基(按质量分数计)

富集培养基：酵母浸粉0.5%、魔芋粉1.5%、NaC10.5%、蛋白胨0.3%、pH7.2～7.4，115℃灭菌30min。

筛选培养基：NH4C10.5%、NaC10.5%、甘露聚糖1.0%、琼脂2.0%、pH7.2～7.4，115℃灭菌30min。

种子培养基：魔芋粉1.0%、蛋白胨0.5%、NaCl1.0%、自然pH，115℃灭菌30min。

初始发酵培养基：魔芋粉2.0%、蛋白胨1.0%、NaCI1.0%、自然pH，115℃灭菌30min。

2、菌株筛选

土壤预处理后进行富集培养，用梯度稀释法处理富集培养液并涂布在筛选培养基上，挑选长势良好且菌落直径大的单菌落进行划线分离，纯化三次以上，斜面4℃保存。

将分离纯化得到的菌株进行摇瓶发酵，发酵后离心得到粗酶液。粗酶液用pH4、0.2mo/L磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液37℃、150r/min耐酸处理1h，后用DNS法测定粗酶液酶活，选择酶活力最大的菌株为供试菌。

3、酶活力测定

取粗酶液0.1mL，加至0.9mL槐豆胶溶液(0.5g槐豆胶+100mL、pH6.0、0.2mol/L磷酸缓冲液)试管中，55℃的水浴反应10min。在试管中加入lmLDNS试剂，沸水浴5min灭活和显色，后流水冷却，定容至10mL。以空白液调零，在540nm处测其吸光度。在甘露糖标准曲线(参考张闻的方法制得)上查得相应的甘露糖含量，计算甘露聚糖酶酶活。

酶活力定义：1个酶活力单位(U)为以pH6.0、0.5%槐豆胶为底物，在55℃水浴中反应10min，每1lmin产生相当于lumolD-甘露糖所需要的酶的量。

式中：Fg-由标准曲线查得的甘露糖微克数、n-稀释倍数、0.1-酶液毫升数、t-恒温时间、180-甘露糖分子量。

4、菌株鉴定

将筛选得到的菌株接种于LB液体培养基培养8～12h，离心收集菌体。采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程股份有限公司)提取细菌总基因组DNA。采用16SrDNA扩增通用引物：

7F：CAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA、27F：AGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT，扩增该菌株的16SrDNA。PCR反应体系：基因组DNA(20～50ng/uL)0.5μL、10xBuffer(withMg2+)2.5L、dNTP(2.5mmol)1μL、酶0.2μL、F(10umol)0.5μL、R(10umol)0.5μL、加双蒸馏水至25μL。PCR循环条件：预变性：94C4min，变性：94℃45sec，退火：55℃45sec，延伸(30cycle)：72℃1min，修复延伸：72℃10min，终止反应：4℃。将获得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工生物工程股份有限公司)回收PCR产物。将PCR得到的16SrDNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，得到测序结果后进入NCBI网站，BLAST对比分析GenBank中现有的细菌16SrDNA，并使用MEGAX构建该菌株的系统发育树进行同源性分析。

5、响应面BOX-Behnken试验设计

在单因素实验结果的基础上，对发酵培养基组成进行响应面优化。选取自变量因素为A-魔芋粉、B-酵母浸粉、C-Mn22+，响应值(R1)为酶活。使用软件Design-Expert10.0.7对上述因素进行响应曲面回归分析，对发酵培养基的组成进行优化。BOX-Behnken试验因素水平表如表1：

二、结果与分析

1、菌株的分离与筛选

将富集培养液的稀释液涂布于筛选培养基，产甘露聚糖酶的菌株会在培养基上生长，以此来筛选菌株。挑选长势良好且菌落直径大的10株单菌落进入复筛，并命名为NSG-1、NSG-2、……、NSG-10。

将筛选得到的10株菌进行摇瓶发酵，用DNS法测定粗酶液酶活力。

NSG-6在经耐酸性实验后酶活力为1.78U/mL相对最高，其正常酶活力为2.05U/mL，故将其作为供试菌株。

加双蒸馏水至25μL。PCR循环条件：预变性：94℃4min，变性：94℃45sec，退火：55℃45sec，延伸(30cycle)：72℃1min，修复延伸：72℃10min，终止反应：4℃。将获得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工生物工程股份有限公司)回收PCR产物。将PCR得到的16SrDNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，得到测序结果后进入NCBI网站，BLAST对比分析GenBank中现有的细菌16SrDNA，并使用MEGAX构建该菌株的系统发育树进行同源性分析。

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